【导读】细胞健康网细胞网整理“细胞冻存及复苏”的细胞简讯，细胞存储、治疗找细胞健康网，细胞冻存及复苏的基本原则的正文：
目录一览：
- 1、求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤
- 2、为什么复苏细胞要慢速冷冻快速复苏
- 3、细胞冻存与复苏过程，应注意哪些细节，以提高细胞存活率
- 4、细胞冻存与复苏的基本原则
- 5、细胞冻存与复苏的基本原则是快冻慢融,为什么?
- 6、细胞冻存的操作步骤是什么？
求助：贴壁细胞的冻存和复苏的具体步骤
贴壁细胞冻存实验准备：
将15mL离心管、冻存管、PBS缓冲液、移液管、电动移液器等物品提前放入生物安全柜中，紫外照射30min消毒灭菌；
细胞完全培养基、0.25%胰酶-0.02%EDTA、细胞冻存液等从4℃冰箱中取出后，复温至室温，备用；程序降温盒复温至室温备用。
贴壁细胞冻存操作步骤：
1. 从培养箱中取出准备冻存的细胞；
2. 显微镜下观察细胞状态并拍照记录；
3. 酒精消毒培养瓶后放入安全柜中；
4. 吸去多余的培养基，加人2~3ml PBS缓冲液润洗一次；
5. 加入1ml胰酶，放入37℃消化；
6. 消化1min左右，在显微镜下观察细胞消化情况；
7. 消化完全后，加3ml完全培养基终止；
8. 将细胞悬液移入15ml离心管中离心，1000rpm/min（约200g）离心3-5min；
9. 吸去多余的液体，向细胞沉淀中加入适量的冻存液，轻轻吸打混匀；
10. 按比例分装至冻存管中；
11. 贴好标签后放入梯度冻存盒中；
12. 将冻存盒放入-80℃，降温过夜后，移入液氮中保存。
注意事项：
1）细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；
2）不同细胞消化时间有差异，以实际镜检结果为准，大部分细胞回缩变圆并有少量细胞脱落即可中止消化，消化时间不宜过长；
3）应选择汇合度80%-90%左右，细胞处于对数生长期时进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；
4）冻存细胞保存温度应低于-130℃，不可在-80℃长期保存。
为什么复苏细胞要慢速冷冻快速复苏
对，必须慢冻快融。
当细胞冷到零度以下时，细胞器会脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，在细胞内形成冰晶。缓慢冷冻可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。相反，冰晶会很大，导致细胞膜、细胞器的损伤和破裂。
复苏快溶可防止小冰晶形成大冰晶（冰晶的重结晶）。
在冷冻细胞时，还应在冻存液中加入DMSO等冷冻保护剂。DMSO是一种渗透性性保护剂，可迅速透入细胞，降低细胞的冰点；可提高细胞膜对水的通透性，促进细胞内的水渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成；稀释细胞内外未结冰溶液中的电解质，减少溶质损伤。
细胞冻存与复苏过程，应注意哪些细节，以提高细胞存活率
首先说一下细胞在冻存过程中的主要威胁：
溶液效应：
原理和内容如图所示
胞外冰晶形成
冻存过程中细胞外形成胞外冰晶的形成会对细胞膜造成机械性损伤
脱水
胞内冰晶形成
原理和内容如图所示
因此在细胞冻存复苏过程中，要从以下几个方面防止上述损伤形成：
总的原则：慢冻快融，即冻存过程要逐步降温，能够使用程序降温仪当然最好了；复苏过程水温要控制适当，一般选择38℃，复苏过程要注意不断摇晃以缩短时间；
选择恰当的冻存保护剂，通常有DMSO，人血白蛋白，甘油，羟乙基淀粉，海藻糖，丙二醇等等，这个最好能自己通过多次摸索，找出一个适合自己所培养类型的细胞的稳定最优的配比组合；
冻存保护剂要提前预冷，滴加过程要缓慢等；
文库里有一篇文章，你可以学习一下：
细胞冻存与复苏的基本原则
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力.
细胞冻存与复苏的基本原则是快冻慢融,为什么?
冻存的原则是：慢冻,主要是防止细胞在冷冻过程中形成冰晶,对细胞造成损害,加DMSO也是这个原理.
复苏细胞的原则是：快融.主要是防止DMSO在液体状态下对细胞的毒害作用,快速使细胞进入复苏和生长状态.
因此,细胞的冻存与复苏原则应该是慢冻快融.分别经过4度,-20度,-80度和液氮的依次过程进行冻存；经过37度水浴1分钟之内解冻细胞冻存液进行复苏.
细胞冻存的操作步骤是什么？
1、配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3、去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4、离心1000rpm，5min；
5、去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6、细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
7、在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8、冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
注意事项
1、从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞用于冻存，最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2、将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3、冻存和复苏最好用新配制的培养液。
【总结】关于“细胞冻存及复苏？细胞冻存及复苏的基本原则”的解读完毕，干细胞治疗，免疫细胞存储找细胞健康网，细胞冻存及复苏的基本原则更多细胞资讯 https://yszxyy.com/
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