【导读】细胞健康网细胞网整理“感受态细胞公司”的细胞简讯，细胞存储、治疗找细胞健康网，感受态细胞的效价的正文：
目录一览：
- 1、新买的大肠杆菌感受态有必要先检验才做转化吗？
- 2、感受态 转化
- 3、2020-08-24质粒构建
- 4、如何设计含attb位点的pcr引物
- 5、pcr试验是什么意思？
- 6、可以针对某一个蛋白提取vlps吗
新买的大肠杆菌感受态有必要先检验才做转化吗？
我一般用的买来的感受态试则含羡剂盒孙拍做感受态，效果都还老歼可以，用的是上海生工的试剂盒，比自己用氯化钙做感受态效果要好。
如果是直接买感受态细胞，我以前买过博大泰克的，价钱比较便宜，转进去也没什么问题。天根也有卖感受态，不过价钱要贵多了
感受态 转化
中国生物论坛
菌落生长密,显然是稀释度的问题。
至于无阳性,最大的可能是裤迅感受态细胞制备,如果可能,直接购买公司制备好的感受态细腊纯州胞吧;其次可能就是转化的条件;
建议你看看分子克隆实轮蔽验指南第三版.
2020-08-24质粒构建
获取一个基因CDS序列的方法如下：
打开NCBI（ ），如下图，按照顺序，在1处选择Nucleotide，在2处输入“PDCD1”，点击3处的Search，等出来结果之后点击4处的“Homo Sapiens”进行进一步筛选（如果你要做鼠源的就选Mus musculus，其他种属选择相应的名称即可进一步筛选了）
然后第一条就是我们需要的序列信息，点击进去，往下拉，直到看到CDS（如下图）
点击闭手灶CDS，就出现了下图中所示内容，其中加了底色的部分序列便是我们需要的序列了，可以看到这段序列开头是ATG起始密码子，最后三位是TGA终止密码子。选中这段序列复制即可。
由于需要PCR整个CDS区域，所以正反向引物并没有多少选择的余地，甚至可以参照上述原则简单粗暴的从正反向各选择22个碱基左右作为引物，例如：!
正向引物序列与CDS相同，反向引物序列与CDS互补。另外要注意的是写引物等序列都是要5’到3’的方向，一般不会从3’到5’，所以我们的CDS虽然没有注明方向，但是其实也是5’到3’。
虽然可以这么简单粗暴的设计引物，但是还是想借此教大家使用一下引物设计的经典软件Primer Premier 5。
Primer 5的使用
如下图，首先点击File-New-DNA Sequence，
然后点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列，选择As is，即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。
下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。
点击左上角的Primer，如下图，S=Sense，A=Antisense
如果对现在的引物不满意，还可以点击Edit Primers编辑序列，如下图，我们删除掉末尾三个碱基，之后需要先点击Analyse，然后才能点击OK，我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。薯缓
最后点击Edit-Copy-Sense Primer，粘贴到Word中即可得到正向引物，反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便。
这轿扮样我们PDCD1用于PCR的正反向引物就初步设计好了。如果你只是想P出PDCD1这个基因，现在的引物就可以送去合成了，但是如果你想将其构建到载体上，那么我们还要对其进行进一步的加工。
Primer 5的使用
根据不同的目的，可以选择不同的载体，如过表达（pcDNA 3.0）、敲减（pLKO.1-TRC）、原核纯化（pGEX-4T1、pET-28a）、病毒包装（pMSCV-puro）、敲除（lentiCRISPR v2）等。下面我们就以过表达载体pcDNA 3.0为例进行讲解。
从质粒图谱上可以看到多克隆位点有多个酶切位点可以选择，那是不是每个位点都可以用呢？当然不是！我们要 选择那些PDCD1（或其他目的基因）本身没有的酶切位点！
所以我们还需要用Primer 5来分析一下哪些是PDCD1所没有的。
还是打开Primer 5，然后粘贴CDS序列，点击Enzyme，2为所有的酶，我们比对质粒图谱选择多克隆位点的酶，双击即可到3的框中，选好之后点击OK，可以看到PDCD1中有ApaI和KpnI两个酶切位点，所以这两个不可以选，其他的都可以选。
不过一般选择常用好用的最好是实验室就有现成的那些酶了。比如我们选择EcoRI和XhoI，那么我们就可以在对引物加上相应的酶切位点了。
于是我们得到如下引物：
好了，我们现在就可以将这些引物送去相应公司合成了。
质粒构建
终于到正题了！
待引物合成之后，我们用ddH2O将其稀释到 100 μM 作为母液，取一些稀释到 10 μM 做下一步实验了。
首先我们P出目的基因，这一步建议用高保真PCR酶，我常用的是 Toyobo公司的KOD-PLUS-Neo酶 。反应体系及反应条件如下图：
模板的获取
PCR完成之后跑1%的胶回收目的片段，也可以直接用PCR Clean试剂盒回收。回收之后将其双酶切，同时需要酶切适量载体。如果你使用的是Fermentas (Thermo)的酶，还可以打开网址 查询双酶切所用的最佳Buffer。
酶切回收之后的片段进行连接，我使用的是 Thermo公司的T4连接酶 ，体系如下：
现在的T4连接酶基本都是快酶，比如Thermo的这款声称10 min就可以连接完成，不过我保险起见，一般连接30 min， 切勿连接过夜！
连接完成之后便是转化，挑菌（单克隆），摇菌抽提质粒，送去测序就OK了！
TRIzol法抽提RNA
提取RNA比较成熟的方法便是TRIzol法抽提，Invitrogen的TRIzol是比较稳定且广泛应用的，当然现在一些国产的TRIzol类产品也能满足大部分情况下的RNA抽提。
ABOUT TRIzol
注意事项及原理
注意事项：
1、RNA酶（RNase）非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又会迅速复性。用常规的高温高压蒸汽灭菌法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。RNase的又一污染源是取液器，一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。提取RNA时使用专门的RNase-free的枪头和离心管。
2、TRIzol试剂具有较强毒性，如沾到皮肤立刻用大量的清洁剂和水冲洗！
溶液配方及原理：
1、TRIzol试剂：TRIzol能在破碎细胞、溶解细胞内含物的同时保持RNA的完整。其主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。异硫氰酸胍，是一种强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
2、氯仿：氯仿可增强TRIzol中的8-羟基喹啉对RNase的抑制作用。另外氯仿作为有机溶剂，加入氯仿后离心可使溶液分层，上层为水相，下层为有机相。苯酚为弱酸性，酸性条件下（一般为Ph5.0）DNA和蛋白质进入有机相，而RNA留在水相；反之亦然，弱碱性（Ph8.0）时DNA留在水相。
3、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇：异丙醇和乙醇能与水任意比例互溶，因此加入异丙醇能够夺取RNA周围的水分，使其脱水沉淀。
4、DEPC水：DEPC是RNase的化学修饰剂，它与RNase的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制其活性。DEPC有毒性，操作时应小心。谁说是最优秀的；谁是最自由的，谁也就是最优秀的，在他们身上，才会有最大的美。
操作步骤
1、细胞破碎
A、组织：按1 mL/50~100 mg组织样品的比例向打散的组织块中加入TRIzol试剂，样品的体积不能超过TRIzol体积的10%。
B、贴壁细胞：按1 mL/10 cm2的比例直接加入TRIzol试剂，并用移液枪反复吹吸数次。TRIzol试剂过少会导致DNA污染。
C、悬浮细胞：悬浮细胞离心收集后，直接按1 mL/5~10×106个细胞（动物、植物或酵母）的比例加入TRIzol试剂。加入TRIzol前不要洗细胞，否则易造成mRNA的降解。
如果样品中含有较多的蛋白、脂肪、多糖或其他细胞外物质，如肌肉、脂肪组织或植物的块根等，可在2℃~8℃，12000×g离心10 min去除这些物质。
关于TRIzol的用量，Invitrogen官方说明书中有建议用量：
一般情况下，根据细胞量的多少我的用量是：2~3 mL/10 cm Dish、500μL~1 mL/6 cm Dish、200~500 μL/3.5 cm Dish（仅供参考）
2、氯仿抽提分层
加入TRIzol后，室温（15℃~30℃）孵育5 min保证核蛋白复合体充分解离。按0.2 mL/1 ml TRIzol的比例加入氯仿。盖紧管盖后剧烈摇晃15s，室温静置2 3分钟。12000×g，2℃ 8℃离心10 min，转速不可过高否则会导致RNA断裂。离心后液体分为三层，下层为红色的有机相（酚-氯仿），中间为白色的沉淀，上层为无色的水相。RNA在上层水相中，水相的体积约为加入的TRIzol体积的60%。
3、用异丙醇使RNA沉淀
将上层水相转移到一个干净的1.5 mL管中，如需提取DNA或蛋白质就保存下层有机相。
加入与水相等体积的异丙醇，室温孵育10 min。12000×g，2℃~8℃离心10 min。RNA沉淀一般附着在远离离心机轴心的管底，为无色胶状。
4、用乙醇洗涤去除残留的蛋白质和无机盐
去除上清后，用1 mL 75%乙醇（用Rnase-free的水配制）洗涤RNA沉淀。震荡混匀RNA后，7500×g 2℃~8℃离心5 min。
5、用DEPC水溶解RNA
去除上清后，将管子敞口晾5~10 min，使RNA沉淀呈现半透明状。不要让RNA沉淀变成完全不透明，那时RNA完全干燥将会大大影响RNA的溶解。根据后续实验要求加入适量的DEPC水，用移液枪反复吹吸数次后。
逆转录法合成cDNA
一般逆转录（也可称作反转录）都有现成的试剂盒，只要大家按照试剂盒的说明书来操作，问题都不大，在这里我就以TAKARA的逆转录试剂盒为例稍加说明。
Random 6 mers 为随机的6核苷酸引物，引物序列为5'-(P)NNNNNN-3'，特点是产物量大，特异性差，适用于长的或具有Hairpin构造的RNA。包括rRNA、mRNA、tRNA等在内的所有RNA的反转录反应都可使用本引物。
Oligo dT Primer 适用于具有Poly（A）Tail的RNA，因而特异性好，但因其只结合Poly A尾巴，对于较长的mRNA，经常不能延伸到5'端。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类真核生物的mRNA等不具有Poly（A）Tail）。
两种引物可据实际情况使用一种，也可同时使用。还有一种情况，当只扩增一种目的基因时，也可以使用Specific Primer（PCR时的下游引物）作为反转录引物。
操作步骤
步骤简述如下：按照下图中1配制溶液，然后65℃处理后加入3中所配制溶液继续后续反应即可。
连接产物的转化
常用的感受态细胞有DH5α、BL21（DE3）、Rossetta等，而抽提质粒一般用DH5α，可以自己制备也可以购买商业化的感受态。
ABOUT Transformation
注意事项
1. 感受态细胞要现用现融，刚刚融化的感受态转化效率最高；
2. 避免反复冻融感受态细胞；
3. 整个操作过程要轻柔，不要用移液器猛烈吹吸；
4. 感受态和连接产物（或质粒）用量要适中，并不是越多越好。
操作步骤
1. 取50 μL感受态细胞置于冰上融化；
2. 加入5 μL连接产物（质粒一般只需用白色枪头沾取一下即可），混匀，置于冰上静置30 min（此时应该打开水浴锅并调温至42℃）；
3. 42℃水浴中热激90 s，迅速置于冰上静置2 min；
4. 加入500 μL无菌的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃，200rpm的恒温摇床中培养1 h，使细胞复苏；
5. 连接产物：3000 rpm离心5 min，弃上清，留取少量LB（50 μL左右），重悬沉淀，全部均匀涂布于LB培养板（需含相应抗生素）上，37℃ 倒置培养 16 18h；质粒：直接取20 50 μL涂于LB培养板上培养即可。
质粒的小量提取
ABOUT 质粒抽提
实验原理：
较常用的质粒提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。前两种方法比较剧烈，适用于较小的质粒（15kb）。去污剂裂解法则比较温和，一般用于分离大质粒（15kb）。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒的方法，其原理为：当细菌暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
由于质粒DNA分子比染色体DNA大得多，且前者为共价闭合环状分子，后者为线状分子。只要碱处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，质粒DNA双链就会再次形成。
在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会互相缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐（SDS）包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去沉淀之后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
本方法采用Tiangen小提中量试剂盒进行提取，其纯化系统是硅基质吸附材料，其原理为在高盐环境下质粒DNA能够结合到硅基质上，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后用低盐缓冲液或水将质粒DNA从硅基质上洗脱下来。得到的质粒可以用于酶切、PCR、测序、细菌转化、转染等分子生物学实验。
实验试剂（试剂盒试剂配方不清楚，以下配方见《分子克隆实验指南》）
1、溶液P1：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl（pH 8.0），10 mM EDTA，100μg/ml RNase A
原理：Tris-Cl用于提供一个合适的缓冲体系；50 mM葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；而EDTA 作为Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，起到了抑制DNase的作用；RNase作用为去除质粒中混有的RNA，其不受EDTA的影响。
2、溶液P2：0.2 N NaOH，1% SDS
原理：0.2 N NaOH的作用在于使细菌裂解，而SDS作用在于加入P3之后是被其包盖的细菌蛋白，染色体DNA一起作为沉淀析出。
3、溶液P3：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸
原理：这一步的K+置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na+，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时染色体DNA也被PDS共沉淀。而醋酸用于中和碱，使溶液恢复中性，从而使质粒DNA复性。
操作步骤
1、将过夜培养的菌液（5-15ml）从摇床中取出，并拧紧盖子，9000 rpm离心10 min，用泵尽量吸除上清。若暂时不提取，可将沉淀保存于-20℃，也可直接将菌液保存于4℃（短时间）。
注意：如果菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。
2、柱平衡步骤：向吸附柱中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL, 12000 rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（请使用当天处理过的柱子）。
注意：若柱子放置较久，需要进行这一步骤；否则，可省。
3、向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA，并置于冰上 ) ，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，并移至2ml离心管中。如果沉淀的菌体较多，则相应增加P1的用量（之后P2和P3的用量也应成比例增加），并分到几个管子中分别进行步骤4和5的操作（不然P1+P2+P3的总体积超过2ml离心管容积），步骤6过上清时可过同一个吸附柱。
注意：菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率。另外，务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4、向离心管中加入500μl溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。由于P2裂解不应超过5 min，以免质粒受到破坏。故加入P2前将计时器定时4 min，以免超过时间。但是时间也不可过短，以免裂解不彻底。每管操作时间尽量一致。
注意：温和地混合不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA 。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
5、向离心管中加入700μl溶液P3（记得冰上预冷），立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。放置冰上10min，之后12000rpm ( -13400g ）离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。如果上清量较大，需要多次过柱，可将上清转移至新的离心管中，以免沉淀飘起。
注意：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
6、将上一步收集的上清液分次加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μl）,注意尽量不要吸出沉淀。 12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
7、可选步骤：向吸附柱中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm（-13400g ）离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
注意：如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM101，ET12567等），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-宿主菌（DH5α，TOP10等），这步省略。
8、向吸附柱中加入600μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（-13400g）离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
注意：加入漂洗液PW后，如果室温静置2-5 min，有助于更好地去除杂质。
9、重复操作步骤8。
10、将吸附柱重新放回收集管中置于12000rpm（-13400g ）离心2 min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱开盖，置于室温放置数min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11、将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μl洗脱缓冲液EB（65℃预热），室温放置或65℃水浴2 min，12000rpm（-13400g ）离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中．重复步骤
11、洗脱液的pH 值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液，应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内（可以用NaOH 将水的pH 值调到此范围）, pH 值低于7.0 会降低洗脱效率。洗脱缓冲液体积不应少于100μl，体积过小影响回收效率，但也不应过大，以免所提质粒浓度过低，影响后面的使用。且DNA产物应保存在-20 ℃ ，以防DNA 降解。
结果判断
1、使用紫外分光光度计对质粒浓度及纯度进行测定
（1）检测波长为260nm和280nm，浓度看OD260，OD260值为1相当于大约50μg/ml；纯度看OD260/OD280，OD260/OD280比值应为1.7-1.9，偏低可能是蛋白质污染，偏高则可能是DNA降解或RNA污染，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。另外，测出来的OD260和OD280都应该在0.1-2.0之间，不然所得出的浓度和纯度不准确。
（2）应该注意的是作为空白对照的blank管稀释方法应该和所测样品管一样（如样品为2μl所提质粒+48μl ddH2O，则blank为2μl洗脱液+48μl ddH2O）。
2、酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测
（1）选用合适的内切酶对所提质粒进行酶切，并与未切质粒及转化用原质粒一起用琼脂糖凝胶电泳检测，根据酶切结果及所提质粒与原质粒位置是否一致，可以判定所提质粒是否为目的质粒。
（2）所提质粒（未酶切）的电泳条带可能为一条带，也可能为二到三条带，这是因为质粒提取过程中操作过于剧烈可能使环状超螺旋结构的质粒DNA单链出现缺口（保持环状，失去超螺旋），或双链断裂（变成线状），三种构型的质粒分子在琼脂糖凝胶电泳中的迁移速率是不一样的，因此会出现多条带，这也说明所得质粒不够理想。
测序结果的分析
构建好质粒之后我们一般先酶切鉴定，鉴定正确的可以直接拿去转染然后做WB检测表达即可。
可以正常表达的质粒我们需要送到测序公司测序，也可以直接送菌液测序，有些测序公司还提供质粒返还服务（即送菌液返还他们抽提的质粒）。
测序的引物一般使用通用引物，如果没有通用引物需要自行设计。常用的通用引物如下：
在公众号内回复“ 通用测序引物 ”获取此Excel！
测序结果返回之后我们就可以分析测序结果了。
一般常用的序列比对软件有DNAMAN和Chromas，当然，还有很多类似软件，大家可以根据个人习惯选择，在这里就不一一介绍了。
DNAMAN
1. 首先打开软件，左侧数字为各个通道的编号，每个通道只能载入一个序列：
2. 然后点击File-New，将我们目的基因的CDS序列粘贴进去，Ctrl+A全选，右键选择Load Selected Sequence，将序列载入通道1。
3. 选择通道2（点击数字2即可），点击File-Open打开测序回来的序列信息（后缀为.seq），同样全选右键载入通道2，之后点击Sequence-Multiple Sequence Alignment；
4. 在弹出窗口中，点击Channel，选中需要比对序列的通道，点击OK即可：
5. 后面基本是一直点击下一步，在如下图窗口中选中Try both strands：
6. 然后一直下一步，出来如下结果，即可比对测序结果和原CDS序列，如果有突变我们需要看一下是否是同义突变，如果是即质粒序列正确。
Chromas
1. 用Chromas软件打开测序返还的序列信息，然后点击File-Blast Search:
如何设计含attb位点的pcr引物
使用Multisitegateway技术构建载体的方运首法 Multisite gateway 实验步骤如下 设计含有attB位点的PCR引物建议使用Vector NTI Advance 软件来设计孝悄猜含有attB和attBr的引物。 上游引物必须同时满足以下条件 含有2225 bp的attB位点 至少1825 bp的模板或插入片段特异性的序列 multisitegateway引物序列的特异性 Fig specificsequences Multisitegateway 下游引物的设计也需满足以上三个条件。 因为我们要在E coli 体内表达蛋白 所以设计上游引物时 要在attB位点之前加上SD Shine Dalgarno 序列来保证翻译的准确性。同时为了保证阅读框的正确性 需要在attB位点之前加上两个核苷酸 但不能是AA AG和GA 因为它们会和attB位点末端的胸腺嘧啶核苷酸T形成终止密码子。 得到PCR产物并电泳检测PCR程序设置和电泳方法同上 需要指出的是 若PCR的模板是包含卡那抗性基因 kanamycin resistance gene 的质粒 需要在电泳检测和纯化PCR产物前对其进行消化 使用的酶是Dpn 作用是为了去除模板对后续反应的干扰。 消化的体系和过程 在50μl的PCR反应体系中 加入5 μl10X REact Dpn37 孵育15 min 65 热激15 min使Dpn BP反应得到entryclone 反应体系如下 BP反应的引物组分Table BPreaction Components Sample Negative control positive control attB PCR product 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW control plasmid 100 ng TEBuffer pH 其中携带attB位点的PCR产物的量可以用以下公式来计算 50 fmoles 2500 bp 660 fg fmoles ng106fg 82 PCRproduct required 实验步骤如下 按上面计算方法和反应体系加入合适体积的pDONRTMvector 和PCR产物 20冰箱里拿出BP Clonase II enzyme mix 放在冰盒上两分钟左右使其解冻。 轻轻涡旋BP酶两次每次两秒钟 BPClonaseII enzyme mix 并立即将其送回 20 冰箱里 样品轻轻涡旋几次使其混合均匀。 25孵育1 蛋白酶K37 孵育10 min。 之后进入转化环节后续实验流程同经典载体构建 最终得到含有attL位点的entry clone。 LR反应组分Table LRreaction Component Sample Negative Control attL4 attR1entry clone 10 fmoles attL2entry clone 10 fmoles attR2 attL3entry clone 10 fmoles pDEST R4 R3 Vector II 20 fmoles TEBuffer pH 使用Infusion方法快速大量构建载体的方法 fusion是一种不依赖于限制性内切酶Restriction Free 的克隆方法 引入此方法的最初动机是为了在一个载体的任意位置引入外源DNA片段。此方法基于DNA片度的扩增
得到的大量的DNA可以作为线性载体扩增的模板。这个方法可实现将多个不同的外源基因同时插入某一个特定的载体的任意我们感兴趣的位置 从而弥补了位点特异性重组系统中对特异位点和特殊系统的需求 为分子克隆和蛋白表达的调控提供广阔的思路和方法。这种方法的原理是DNA片段之间的同源重组 现在应用比较广泛的是由Clontech公司提供的In FusionTM system
它可以实现以下克隆需巧型求 同时克隆多个DNA片段 Simultaneous cloning 基因的替换 Gene replacement 多位点突变 Multisite mutagenesis 多组分重组 Multi componentassembly 同时插入和删除基因 Simultaneous insertionand deletion 引物设计及目的基因片段扩增该方法的原理和步骤同前in fusion PCR 只是这个方法中PCR产物需用Dpn 将模板消化。
载体线性化载体线性化的方法既可以用特异性酶切消化也可以通过常规PCR 使用PCR的方式使载体线性化消除了对特异性酶切位点的依赖和限制 同时彻底实现载体和片段之间的无缝连接 消除后续由于特殊碱基序列的加入对实验结果的影响 同时大华 35大节省了时间和成本投入。
fusion“连接”反应将纯化的DNA片段和载体按照2 1的摩尔比混合入250 EP管中必要时可以加入In fusionTM enzyme 由Clontech提供 和相应buffer 是反应总体系为10 μl。之后共同转入感受态细胞 进入筛选环节。 感受态细胞的制备在线虫载体构建的整个过程中 最重要的实验材料是各种促进反应进行的酶和高转化效率的感受态细胞。不同的载体因其携带筛选基因或者特异表达的宿主的不同 需要诸如DH5α、TOP10等不同类型的感受态细胞 例如在Multisite gateway反应中 通常需要借助ccdB的筛选机制 这种情况下就不能使用携带有ccdA基因的菌株 如TOP10F’ 。
所以 在不同方法的构建中 要严格选择感受态细胞类型。以下以实验室常用的感受态细胞DH5α为例 详述用氯化钙 CaCl2 法的制备过程。 用CaCl2法制备感受态细胞的原理是通过低渗的CaCl2溶液在低温 时处理快速生长的细菌从而得到感受态菌株细菌外形膨胀为球形 这样的形态结构有利于外源DNA分子形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物 这种复合物会粘附在细菌表面 如果热激 细胞对DNA的吸收将大大加强。 实验的关键是选取出于对数生长期的菌株 所有的操作必须尽可能保持在完全无污染无杂菌并且低温的条件下进行。
实验材料及准备事项 100ml 胰化蛋白胨 CaCl2的制备称取22 CaCl2溶于200ml事先灭菌的水中 充分溶解后保存于4 冰箱中。
将浓度为100的甘油120 高温灭菌。 器材10 ml移液管 需灭菌玻璃大培养皿 内铺一张滤纸 需灭菌大、中、小枪头各一盒 需灭菌 50 ml离心管 mlEP管 用铁饭盒灭菌 100 ml SOB培养基需40个EP管 步骤如下 80冰箱里取出DH5α 常温使其冻融后通过接种环接种细菌与无抗培养皿中。将培养板放入3 将预先水浴锅灭菌的15ml离心管放在超净台中 紫外照射半个小时以上。从培养皿上挑取单个菌落 接种至离心管中 导入3 ml无抗培养基LB 37 摇床振荡过夜培养 转速为300 rpm 。次日取1 ml菌液接种至100 ml LB培养基中 以215 rpm的转速37 培养2 3小时。期间 要每隔半个小时测定一下600 nm的OD值。 停止培养将烧瓶置于冰上10 15分钟 同时将预先灭好菌的50 ml离心管也置于冰上冷却至0 在超净台中将菌液尽可能平均的分装入两个50 ml离心管中 以4000 rmp的转速离心10分钟。 弃上清将离心管倒置在滤纸上1分钟 以吸干残留的培养基。每个离心管中加入5 ml预冷的浓度为0 1M的CaCl2溶液 重悬菌体 并开始计时 可以用移液枪轻轻反复吹打30分钟。 将悬浮好的菌液再次以4000rmp的转速离心5分钟 去掉上清 吸干残余培养基后 每管加入2 ml预冷的浓度为0 M的CaCl2溶液反复吹打以重悬菌体 此时可以将两个离心管合为一个 放于冰上预冷20分钟 这期间 可以将已灭菌的1 mlEP管放于冰上预冷。 加入500 μl浓度为100 的甘油 mlEP管中。等全部分装完成时 投于液氮中1个小时 之后再转移到 80 冰箱中。 细菌转化效率的检测方法 设置阳性对照和阴性对照 阳性对照是为了估算细菌的转化效率 阴性对照是排除感受态细胞被污染的可能 及查明失败的可能因素。 阴性对照 只将感受态细胞涂于含某种抗性的平板上 而不加入任何DNA 正常情况下不应该有单菌落出现。 阳性对照 选择标准质粒 一般是pUC19 以50 pg、100 pg的量分别转化到感受态细胞里 将平板放于37 培养箱里过夜培养。数单菌落的个数以估计感受态的转化效率。
效率估算公式为 转化率 1000克隆 10pg DNA 当此值达到1 106时 可满足一般克隆的实验需求 当此值达到1 107时 可用作更复杂克隆的构建需求。 线虫的显微注射通过将外源基因显微注射到雌雄同体的线虫的性腺 gonad 能够获得有种系特异性的线虫。DNA片段可以通过染色体之间的同源和非同源的整合被传递到下一代中。显微注射的步骤如下 制作Pad将配置好的2 的琼脂糖放在水浴锅内防止其凝固。吸取100 μl于干净的载玻片上 并迅速将另一块载玻片轻压上面 待琼脂糖稍微干燥时取走载玻片 标记Pad的正反面之后放于干燥箱 80 中过夜。
拉制电极常常用含有内芯的硼硅玻璃微电极作为注射用电极 该电极的外径为1 nm内径0 75 nm。用拉制仪拉制好的电极尖端是封闭的 在用之前需要打开一个开口 开口的大小要适宜。
准备注射液注射液的体系一般选取10 目的载体质粒的浓度范围为110 μl。其余体积用1TE补平。以12 000 rpm转速离心3分钟。 吸取1μl注射液到拉好的电极中 放置1520分钟 目的是为了使注射液通过内芯的虹吸作用流入电极尖端 并排除内气泡。 拿出注射要用的Pad在上面滴一滴油 保证有足够的油使线虫减慢干燥的过程 但不能太多以使其移动。 用一个干净的针needle 触碰到油上面 挑取N2时期的成虫 线虫挑取的区域应该远离菌斑所在位置 以避免将菌落带到pad上面。选择有容易辨别的gonad的线虫也同样重要。将线虫垂直放在pad上 使其gonad位于左侧 通常 线虫的阴部 vulva 会指向与needle的方向 两侧的gonad会直接与体壁对应。 当needle恰好位于载玻片上时将线虫聚焦在10 的物镜下 确定看到线虫的gonad。将线虫以和needle成15 到45 的角度摆放 通过轻轻降低needle使其和线虫出于同一水平。转换到40 物镜 聚焦到胞体的gonad 使用调试器上下移动needle 直到针尖对准胞体的gonad。 轻轻沿着needle移动线虫当needle插入线虫体内时 按照gonad和虫体壁处于相反位置的方式轻轻压线虫。轻旋调节器 knob 开始DNA注射液的流入 快速的开合 如果needle确定位于gonad处 此处部位会膨胀并充满液体。如果液体流动不畅 轻轻触碰桌面有助于解决此问题。要避免因加入液体过多导致液体沿着needle进入部位流散到线虫的其他部位。 将needle从线虫中拿出建议沿着逆时针方向。回到10 物镜下 滴一滴M9 buffer使线虫悬浮。使用眉毛挑将线虫放置于另外一个含有M9 buffer的板子上。这样做的目的是为了洗掉多余的油。再将线虫挑到含有细菌的板子上。一个板子上可以放置多条注射后的线虫。
两三天后 数F1转基因线虫 并将折射成功的线虫单独转移到板子上以得到有稳定转基因种系的线虫。 显微注射线虫的gonadFig elegansgonad 3910 可能出现的问题及策略 注射后线虫破裂或者死掉的原因可能是needle太大了 或者线虫缺水死亡 方法可能是每注射一个线虫的gonad就换一个新的needle 如果线虫没有直立 原因可能是pad太薄或者需要没烘干 可以通过将板子放在罩子上几个小时来烘干 如果线虫干的太快 可以使用更薄的pad或者在注射前将线虫转移到较湿的板子上。 实验结果与讨论实验中用到的质粒的构建方法 在前言部分和方法部门已做了详细阐述 需要研究的相关基因的启动子的信息 诸如启动子大小 表达部位等 借助于相关文献的报道 在Wormbase中截取特定长度的DNA序列 在NCBI中查找此基因的上下游序列和基因方向 借助网页UCSC提供的序列信息最终得到启动子序列。但在设计启动子引物时 必须留意到序列中3’端和5’端的序列可以根据引物的匹配性在小范围内适当调整。还有一些神经元的位置因为缺乏确切表达谱的启动子而无法最终确定。
线虫有302个神经元 标记这些神经元需要大量的质粒构建。在实验初期 我们通过传统酶切连接方法和改造的常用线虫载体组成的BP反应来实现。但随着课题的发展和方法的改进 我们发现Multisite gateway方法更为便捷和高效 特别是在购买了雌雄同体线虫启动子库后 这种技术不仅被用来标记线虫神经元 更多的用在rescue实验和钙信号的测定的构建中。同时 为了使整个课题有一套完整的体系 我们又花费大量的精力将之前不太标准的由gateway反应得到的构建进行了改造 得到一个可以通用的表达体系。 改造Multisitegateway 中的载体pDESTR4 R3为pPD49 26 R4 R3 在使用Multisite gateway 技术构建多克隆载体的过程中 我们发现 这个系统并不是完美的
因为这个系统中各个重组位点的序列有一定的相似性 所以如果想要插入载体的片段的序列 特别是与引物匹配的那一段 与重组位点有相似性时 可能会导致这个技术中所涵盖的反应失败。同时 当我们想用一个启动子驱动不止两个以上基因的表达时 不能直接只用Invitrogen公司提供的试剂盒中的pDESTR4R3 因为外源基因在线虫体内表达时 需要3’UTR稳定整个翻译过程中的顺利进行 但该公司试剂盒提供的载体中不含我们需要的3’UTR 因此 我们改造了一个新的LR反应的载体pPD49 26 R4R3 因为pPD49 26中含带unc54 3’UTR 而且实验证华 41明我们改造的载体同样有很高的反应效率 1在Multisitegateway反应中验证pPD49 26 R4 R3的有效性 Pgpa 4特异性标记ASI神经元 可以驱动TagRFP t在此神经元中表达。 为明场与荧光共定位的图。Fig pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI can 改造attL1Promoter attL2为attL4 promoter attR1 验证adaptor clone 如前所述 我们将携带attB1 attB2位点的启动子进行改造得到了标准Multisite gateway反应中的第一个entry clone 在这个改造的过程中 需要引入一个中间反应物 adaptor clone。如果我们可以观察到改造后的启动子能够驱动荧光蛋白在特定部位表达 由此可以验证adaptor clone的有效性。在本课题中 我们使用改造后的启动子Pdaf 7驱动荧光蛋白在神经元ASI里表达 由此adaptor clone的有效性得到验证。
pcr试验是什么意思？
PCR目录
〔PCR原理〕
PCR反应体系与反应条件
〔PCR步骤〕
〔PCR检测〕
〔PCR反应特点〕
[PCR仪器]
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。
DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现 ，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称 Taq polymerase), 则是于1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的 酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与 Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。
[编辑本段]〔PCR原理〕
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也绝衡可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵埋磨，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[编辑本段]PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、弯宏斗模板和缓冲液（其中需要Mg2+)
[编辑本段]〔PCR步骤〕
标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA
2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如图所示：
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。
[编辑本段]〔PCR检测〕
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。
[编辑本段]〔PCR反应特点〕
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。
简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
〔PCR的循环参数〕
1、预变性（Initial denaturation）．
模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。
2、引物退火（Primer annealing）
退火温度一般需要凭实验（经验）决定。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
3、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
延伸时间随扩增片段长短而定。
4、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。
5、循环数
大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。
6、最后延伸
在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。
（四）PCR中的污染和假阳性
PCR中污染主要来自
1、样品间交叉污染；
2、先前PCR产物遗留（carry-over）
[编辑本段][PCR仪器]
pcr仪器的发展
pcr温度循环至关重要，pcr扩增仪各参数必须准确。自perkin –elmer cetus公司第一台pcr扩增仪问世以来，现已有几十家不同的厂家在国内外生产和销售pcr扩增仪。在短短的几年间，扩增仪经过几代的发展，不断采用新技术，并且进一步朝方便、实用、高智能化和自动化的方向发展。
为了便于了解和选购适宜的pcr实验设备，现将部分国内外pcr扩增仪列表如下（表22-5）；这些仪器主要用变温铝块、变温水浴及变温气流的方式达到热循环的目的，各有其优缺点。国产1109型dna扩增仪则是用恒温浴机械手移位式。更接近于手工操作。ptc-51a/b体积小，智能化与自动化程序高，可以兼做套式pcr，方便实用。以上各种仪器一般都配有微电脑自动控制温度、时间及循环数，可以达到节 省劳动力的目的。在采用这些仪器作pcr试验之前，一般均应实测管内温度变化循环情况，以了解升、降温时管内因热传导造成的温度滞后情况和实际到达的最高、最低温度，用于修正设计的循环参数。温度滞后受到所用eppendorf管材料、壁厚及形状（与铝块孔匹配程度）的影响，这对变温铝块式仪器影响更大些。对于配用制冷机式半导体元件致冷的仪器，在使用低于室温的温度来保冷pcr反应后小管时，应注意冷凝水的问题，勿使流入仪器内浸湿半导体元件而损坏仪器。
国内外生产的几种dna扩增仪
1109型
北京新技术所与军科院联合
机械臂
变温水浴
电子调温
40×0.5ml
16400元/台
90a/b型
中科院遗传所
机械臂
变温水浴
电热
14000元/台
ptc-51a/b型
军事医学科学院
变温气流
电子调兼作套式
30×0.5ml
12000元/台
dna thermal cycler
perkin –elmercetus(美)
变温铝块
压缩机致冷
48×0.5ml
us $ 20000.-
thermocycler
＃60
＃00
＃180
b..braun
biotech
(德)
变温水浴98℃四档
电热,自来水冷却
60×1.5ml
100×1.5ml
180×1.5ml
dm 30000.-
automatic temperature cy-cler single block twin block
ericomp inc.(美)
变温铝块25～100℃
电热,自来水冷却
29×1.5ml
58×1.5ml
us $4985.-
us $7980.-
grant autogen
grant instrumant ltd(美)
变温水浴0～99℃
电热,自来水冷却或加冷循环器
50×1.5ml
or
50×1.5ml
us $250. –plus
us $ 15.-for
rack(x2)
techne phc-1
phc-2
techne ltd.(英)
变温铝块0～99℃三档
电热500w水冷100w
54×0.5ml
54×0.5ml
24×1.5ml
￡3383. –
￡3997. -
biooven
biothrm corp(美)
变温气流
-150℃
115v 11a
200’s of 4×96plate
us $ 2990. -
trio-thermo-block tb-1
biomertra(德) 半导体变温
220v
3×20管
分别控温
dm12900. -
micro cycler e
eppendorf(美) 变温铝块
220v/100v
3×29管
us $ 3500. -
〔PCR常见问题〕
PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性
出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。
克隆PCR产物
1)克隆PCR产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。
2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A）涂布未转化的感受态细胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。
B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。
例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。
铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为：
1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug
转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞
如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。
C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。
D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。
E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
可以针对某一个蛋白提取vlps吗
猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用与流程
文档序号：22736306发布日期：2020-10-31 09:14阅读：266来源：国知局
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猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用与流程
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
背景技术：
猪细小病毒(porcineparvovirus，ppv)是一种耐受性极强且具有高度传染性的病毒，是导致母猪繁殖障碍的病原之一，猪细小病毒病的临床主要特征是妊娠母猪流产、胎儿死亡和木乃伊化。该病与断奶仔猪多系统衰弱综合征以及猪渗出性皮炎等疾病有关，易感成年猪如果在交配期间或者妊娠期间暴露在ppv存在的环境中，该病毒会很容易穿过胎盘屏障感染胚胎和胎儿。调查发现该病呈全球性分布，特别对妊娠母猪和仔猪危害较大，阻碍了猪养殖产业化进程，经济损失巨大。所以对于ppv的预防、诊断就显得尤为重要。
病毒样颗粒(vlps)是由病毒的衣壳蛋白形成的空心颗粒，具有和天然病毒粒子相同或相似的形态，但不含病毒遗传物质，不能自主复制，因此不会产生任何可能导致感染的遗传成分。并且衣壳蛋白组装成vlps时，通过各亚单位之间的相互作用可以形成单个蛋白不具有的立亩厅迟体构象，而且可以重复并高密度的展示抗原位点。因此相对于单个病毒蛋白，使用vlps对血清抗体检测具有更强的免疫原性和更高特异性。vlps的天然生物学结构类似于亲本病毒颗粒，可以近乎完美的展示诱导中和抗体的抗原表位，因此免疫性强，不但能激发体液免疫反应，还可以激发细胞和粘膜免疫。vlps具备安全、高效的特点，是未来具有广阔发展前景的候伏亏选疫苗或传递抗原的载体。
目前ppv的诊断方法主要有免疫过氧化酶单层细胞实验(ipma)、间接免疫荧光(ifa)、间接elisa以及竞争elisa等，但由于ipma和ifa要求比较高，不适合大规模的ppv抗体检测。目前用于检测ppv抗体的elisa方法大多是以灭活病毒、重组病毒、单个蛋白或多肽等作为抗原，但是以完整病毒粒子作为抗原存在安全风险，单个蛋白或多肽的免疫原性相对较差。
因此，现有技术有待于进一步发展。
技术实现要素：
本发明申请的目的在于解决现有技术的缺陷和不足，提供一种特异性强、敏感性高、稳定性好的用于猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒及其制备方法、应用。
为实现上述发明目的，本发明提供一种猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，包括预包被猪细小病毒vlps的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。迅李
所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，所述猪细小病毒vlps通过以下步骤制得：
1)对猪细小病毒毒株结构蛋白vp2基因序列进行密码子优化合成，并基于优化后基因序列制备puc-vp2重组质粒；
2)利用puc-vp2重组质粒和psmk载体质粒构建重组质粒psmk-vp2；
3)将重组质粒psmk-vp2转化大肠杆菌并诱导表达得到vlps。
所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，猪细小病毒毒株结构蛋白vp2基因序列进行密码子优化合成，合成后核苷酸序列如seqidno.1所示。
所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，利用puc-vp2重组质粒和psmk载体质粒构建重组质粒psmk-vp2具体为：
1)将puc-vp2重组质粒按照如下酶切体系进行酶切：puc-vp2质粒35μl，bsai和bamhi各2.5μl，cutsmartbuffer5μl，ddh2o5μl；
将psmk载体质粒按照以下体系进行酶切：psmk载体质粒35μl，bsai2.5μl，cutsmartbuffer5μl，ddh2o7.5μl；
上述两酶切体系通过琼脂糖凝胶电泳确认puc-vp2重组质粒和psmk载体质粒切开后，回收基因vp2目的片段和psmk表达载体；
2)将基因vp2目的片段和psmk表达载体两种胶回收产物按照以下反应体系进行连接，反应体系为：vp2目的片段4μl、psmk表达载体1μl、5μlsolutioni，混匀后16℃连接反应4h或者4℃过夜连接；
3)将连接产物转化trans5a克隆菌；
4)将trans5a克隆菌接种于含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养16h，将过夜培养后的菌液通过全菌pcr法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒psmk-vp2。
5、根据权利要求4所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，所述将连接产物转化trans5a克隆菌具体为：
1)将5μl连接产物加入100μltrans5a感受态细胞中，柔和混匀后冰浴30min；
2)42℃热激90s后，立即冰浴3min；
3)加入42℃预热后的lb液体培养基800μl，于37℃震荡培养1h；
4)离心机4500rpm离心3min；
5)弃除部分上清，留100～300μl涂布在于含有50mg/l卡那霉素的lb琼脂平板上；
6)37℃恒温培养箱中倒置培养16～18h。
所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，所述将过夜培养后的菌液通过全菌pcr法和酶切凝胶电泳分析，鉴定出重组质粒psmk-vp2具体为：将过夜培养后的菌液接种于10μlpcr缓冲液体系中，利用全菌pcr法进行鉴定，将pcr反应鉴定为阳性的菌落，利用小量质粒提取试剂盒提取对应扩增菌的质粒，并进行双酶切鉴定，其双酶切体系如下：psmk-vp2重组质粒6μl，xbai1.5μl，xhoi1.5μl，cutsmart1μl，37℃酶切3h，重组质粒psmk-vp2双酶切反应结束后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，将鉴定阳性的质粒进行测序，测序结果正确的阳性质粒命名为重组质粒psmk-vp2。
所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，其中，所述将重组质粒psmk-vp2转化大肠杆菌并诱导表达得到vlps具体为：
1)将测序结果正确的阳性质粒转化入de3-ril感受态细胞，37℃恒温培养1h后，取200μl均匀涂布于含有50mg/l卡那霉素和34mg/l氯霉素的双抗性固体lb平板中，并置于37℃、220rpm恒温培养箱培养12～16h；
2)挑取单个菌落于含有50mg/l卡那霉素和34mg/l氯霉素双抗性的液体培养基中，37℃培养过夜，然后以1：100的接种量转接于含50mg/ml卡那霉素和34mg/ml氯霉素的lb液体培养基，于37℃、220rpm培养至菌液od600值在0.7左右时加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度为0.6mm，16℃诱导表达18h左右，随后以4500rpm离心30min收集菌体沉淀；
用10-20ml冰浴处理的缓冲液a重悬细菌沉淀，冰上超声破碎菌体细胞；4℃条件下，将超声裂解的菌液12000rpm离心30min，取上清液；his-sumo-vp2蛋白通过亲和层析进行纯化，将上清液转移至由缓冲液a预平衡的镍亲和层析树脂层析柱中，4℃条件下结合1h，轻摇确保树脂与靶蛋白结合；上清液过滤两次，然后用缓冲液a洗涤蛋白，接着用缓冲液a与缓冲液b按19∶1，9∶1配成不同浓度的咪唑浓度洗脱杂蛋白，最后使用缓冲液b洗脱目的蛋白，每次洗脱1ml，其中，缓冲液a的ph8.0，由20mmtris-hcl，500mmnacl，5mmimidazol，0.1％triton-100，2mmdtt组成；缓冲液b的ph8.0，由50mmtris-hcl，500mmnacl，500mmimidazol组成。
一种如上所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒的制备方法，其中，
封闭液为10％牛奶；
酶标板的制备：
将vlps按包被量为每孔0.5ug/ml均匀的包被在酶标板孔上，37℃1h+4℃过夜；然后每孔加入300μl洗涤液洗板3次，甩干，每孔加入100μl的10％牛奶37℃封闭1h；
所述酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗猪igg酶结合物；
所述样品稀释液为含有体积浓度0.1％tween-20的0.01mol/l及ph7.2-7.4的磷酸盐缓冲液；
浓缩洗涤液通过在1000ml的0.01m磷酸盐缓冲液中加1mltween-20制得；
酶底物溶液为四甲基联苯胺溶液；
终止液：取54.34ml浓度为98％的浓硫酸加蒸馏水至1000ml制得2nh2so4。
一种如上所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒的应用，其中，所述猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒应用于血清中猪细小病毒的抗体水平检测。
所述的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒的应用，其中，所述猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒的操作步骤如下：
将待检测样本用样本稀释液1∶200稀释，每孔加100μl，，同时加入阳性和阴性对照液，置于37℃孵育1h，每孔加入300μl洗涤液洗板3次，甩干，每孔按1∶3000加入酶标二抗100μl，置于37℃孵育1h；洗涤液洗板3次，甩干，加入酶底物溶液，每孔50μl，37℃避光显色15min，加入终止液50μl，。利用酶标仪在450nm测定光吸收值od450；
当血清od450值大于0.36时，判定为阳性；血清od450值小于0.31时，判定为阴性；血清od450值介于0.31-0.36之间时，判定为可疑。
本发明的有益效果：
本发明首次用猪细小病毒的病毒样颗粒作为包被抗原，建立了可检测猪细小病毒的试剂盒，可对血清中的猪细小病毒的抗体水平进行快速检测；
本发明敏感性高、特异性和可重复性好，结果稳定。可应用于猪细小病毒的抗体水平监测，了解整个猪群猪细小病毒病抗体的状况；
本发明采用的病毒样颗粒对操作者和环境安全无害、无传染性；
本发明应用大肠杆菌表达系统具有经济、廉价的优点。
附图说明
图1为本发明具体实施例中对表达的猪细小病毒vlps的sds-page检测结果图。
图2为本发明具体实施例中对表达的猪细小病毒vlps的westernblotting检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明提供一种用于检测猪细小病毒抗体的elisa检测试剂盒，同时提供这种病毒样颗粒的制备方法及elisa检测试剂盒的制备和使用方法。
本发明的猪细小病毒vlpselisa抗体检测试剂盒，包括预包被猪细小病毒vlps的酶标板、封闭液、样品稀释液、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液。
其中、猪细小病毒vlps的制备步骤如下：
1、ppv主要免疫性基因vp2的人工修饰合成
基于已公布的ppv毒株结构蛋白vp2基因序列(genbank登录号：ay459350.1)，根据大肠杆菌密码子偏爱性，对ppv-vp2基因序列(1757bp)进行密码子优化合成，其核苷酸序列为seqidno.1所示。含有puc-vp2质粒的甘油菌由金斯瑞生物科技有限公司制备。
2、重组质粒psmk-vp2的构建合成目的质粒
a.puc-vp2的抽提
将含有puc-vp2质粒的甘油菌液以1：100接种于5ml含amp(100mg/l)的新鲜lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，然后提取质粒。
b.载体及目的片
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