培养内皮细胞?培养内皮细胞的培养

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目录一览:

内皮细胞培养不贴壁,是什么原因

1 细胞消化握做吹打损伤,或污染

2 培养瓶没涂多聚赖数握氨酸薯皮庆或胶原

3 细胞密度不够

4 培养基出问题,污染或酸碱度不对

HUVEC人脐静脉内皮细胞培养要点

1984年,HUVEC细胞株由Hiroyoshi Hoshi、Wallace L.Mckeehan从一段长约10-20cm的人正常脐带静脉中获取、建立。

SetsukoShioda等人研究发现,HUVEC细胞株18-30代的倍增时间为23.5个小时,24-27代的倍增时间为67个小时,27-30代的倍增时间为84个小时,32-34代的指磨倍增时间为100个小时。培养至40代后,细胞形态出现多样化,有些细胞变大或变小,有些细胞出现多核;细胞密度下降、倍增时间延长。最后细胞在第54代停止生长,ATCC的预期寿命也显示在50-60代。

2018年,Setsuko Shioda等人发现HUVEC细胞株(passage 31)在贴壁汇合时细胞与细胞之间存在间隙,这与典型的内皮细胞特征有所不同。

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4 mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm器皿中,加入约8 mL培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。

细胞冻存

冻存条件

60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO,液氮储存

【推荐海星HyCyte™一步冻存液(即用型、无血清、无需程序降温)】

1. 待细胞生长至可传代的密度,即可准备冻存。

2. 消化细胞,取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清,用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×106个/mL。

    注意: 细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计唯猛斗数,请将细胞放置于4℃冰箱内,以减弱细胞代谢,较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液,冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液,需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

     注意: 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。

培养基: 内皮细胞培养基知庆础培养基+5% FBS+1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S

推荐传代比例: 1:3-1:4,每2-3天换液一次

培养条件: 气相:95%空气+5%CO₂,温度:37℃

细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。

1. 预热完全培养基、胰酶、PBS

2. 弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

3. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA 货号: GUTP-R001)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。

4. 按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。

5. 将细胞悬液按1:2到1:4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。

1. 该细胞为有限传代细胞系,在体外培养可传20代。请注意代次控制。

2. 该细胞培养难度较高,建议使用专用培养基。

3. 永生化的人脐静脉内皮培养体系: 内皮细胞基础培养基+5% FBS+1%内皮细胞培养添加剂+1% P/S。

推荐使用海星人脐静脉内皮细胞完全培养基,货号:TCH-G406。

4. 如选择使用其它品牌培养基,可选:

(1) 内皮细胞基础培养基推荐:ScienCell(Cat.No.1001)

基本成分介绍:永生化的人脐静脉内皮培养体系是专门为血管内皮细胞体外培养设计的最适于其生长的完全培养基。包含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质和低浓度胎牛血清(5%)。该培养基的配方能够选择性的促进正常血管内皮细胞体外培养中的增殖和生长,并为其达到最理想营养平衡状态。

(2) 胎牛血清推荐:HyCyte™干细胞预筛选胎牛血清 (Cat.No.FBP-S001)

基本成分介绍:适用于有较高要求的细胞和较难获得的细胞,如血管内皮细胞。

(3) 内皮细胞培养添加剂推荐:ScienCell(Cat.No.SC1052)

基本成分介绍:内皮细胞培养添加剂(ECGS)是一种从牛脑垂体提取的培养基补充剂,含有培养血管内皮细胞所必需的生长因子、激素和蛋白质。该补充剂最大限度地促进永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的生长,该因子的添加对维持永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)形态至关重要。

(1)请务必使用以上两种推荐培养体系进行永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养,否则可能导致细胞无法增殖。

(2)T25瓶细胞由于运输过程影响细胞会分泌产生的少量小黑点,不是污染问题,属正常现象,使用专用培养体系进行培养后黑点会逐步减少。

(3)永生化的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对血清的品质要求较高,请使用高品质胎牛血清进行培养。如细胞状态欠佳,建议将胎牛血清的浓度提高到10%。

内皮细胞培养要用什么培养基

sciencell的内拍蠢伏皮细胞培养基ECM挺好的,他们的培养基是成套的,不用再额外买试剂了,还是很方便的,我们实验室一直都用这个,希望对你有袭携帮助档答

怎样促进内皮细胞生长

理论上陪袭来说芦没兄说:大部分(没有说全部啊)促进血管生成的因子都可以促进内皮细胞生长。

其中的细胞因子有:bFGF、VEGF、PDGF、EGF等,实验中常用的有ECGF、ECGs,bFGF,VEGF;选用血清最好用进口的胎牛血清,浓度不低于20%;另外,添加肝素,可以促进bFGF与内皮细胞结合促进内皮增察雀殖,并且抑制平滑肌细胞增殖;传代时候一定要密度比较高;换液不能全换,最好换半液,或者2/3。

内皮细胞的取材和原代消化是很重要的过程,即取材来源一定要健康,最好是越年轻越好,如果是脐带的话越新鲜越好,产妇的身体越健康越好;原代消化千万不要对内皮损伤太厉害,否则后面很难挽救,这些都是内皮细胞的先天之本,后面的培养是后天之本,先天不足,后天很难补的;先天足的话,后面培养很容易的。

求助血管内皮细胞培养基

血管内皮细胞培养基

上皮细胞培养1)表皮细胞培养1.取材:取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮肤更好,切成0.5~1 平方厘米小块.2.EDTA 处理:先置入0.02%EDTA 中室温置5 分钟.3.冷消化:换入0.25%胰蛋白酶中,置4℃过夜.4.分离:取出皮肤,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开.5.温消化:取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25%胰蛋白酶中,37℃再消化30~60 分钟.6.用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液.7.培养液:通过80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和20%小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2 温箱培养.2) 乳腺组织培养直接培养法:(适于培养含纤维少的软组织)1.在含有少量培养液或Hanks 液的容器中,用锋利刀片将组织反复切割成碎块.2.把组织碎块连同液体注入离心管中,再补加少许培养液,用吸管吹打片刻,置试管架3~5 分钟.吸除上层液可排除非乳腺细胞部分.重复2~3 次.3.末次处理结束后,向沉降管中再补加培养液,用吸管稍吹打,使沉降物重悬.不待细胞团块下降立即通过3~4 层无菌纱布滤入另管中.4.调整好适宜密度,接种入培养瓶中培养.胶原酶消化法:(适于处理含纤维多的较硬组织)其过程与培养其它组织相同.3) 胃上皮细胞培养1.取材:取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许.2.清洗:用含庆大霉素(400 微克/毫升)和二性霉素(2 微克/毫升的Hanks)液漂洗后,用钝器剥离下粘膜,剪成1mm3 大小.3.消化:在I 型胶原酶和透明质酸酶中,于37℃中消化80 分钟.4.离心:收集细胞悬液,800 转/分离心后,Hanks 液漂洗两次.5.接种:末次离心后加入含有1%~2%胎牛血清的完全培养基,接种入不同孔数的培养板中,接种量依不同实验目的而定.4) 肝细胞培养初代组织块培养:取新鲜肝脏,先剥除被膜和血管等纤维成分,用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3 左右中亏的小块,采用帖壁培养法.初代消化法培养:1.把肝组织切成2~4 立方毫米的小块,用不含钙镁的BSS 液洗两次.2.移入1:1 的0.1%胰蛋白酶和0.1%胶原酶(都用无钙镁BSS 配置)中,4℃冷消化10~12 小时后,通过250 微米和64 微米尼龙网或不锈钢纱网滤过.3.收集细胞、BSS 液洗1~2 次、计数、接种培养.消化培养肝细胞的另一种方法是灌流法(肝脏灌流需用全肝,以较小动物如小鼠和大鼠为好):1.无菌解剖动物,取出肝脏,先用BSS 洗除血污.2.取5ml 注射器一支,吸取消化液后,把注射器头轻轻插入肝管中,用线绳结扎牢固,以防消化液漏出,轻轻把消化液注入肝管系统,并不时轻揉压肝脏,以便消化液进入肝小叶中;消化液在肝内停留20~30 分后,在吸出消化液的同时并轻揉压肝脏,以使肝细胞脱落和消化液吸出.3.待吸净消化液后,注入离心管中,低速离心分离,用RPMI 1640 培养基培养(较其它培逗培罩养基为好),能获得较纯的肝上皮细胞和获较好的效果.传代培养:待细胞生长连接成片后,用BSS 洗一二次,加1:1 的0.025%胰蛋白酶和0.02% EDTA 混合消化3~5 分钟,待细胞回缩,便停止消化,弃掉消化液,用BSS洗一二次,注入营养液,吹打,制成细胞悬液,再接种培养.5)内皮细胞培养1.取产后的新鲜脐带.如不立即培养可以保存于4℃中,但不宜超过12 小时.无菌剪取长10~15 厘米一段.其它如胚胎和幼体动物的大血管,亦可用于培养.2.先用三通注射器吸温PBS 液注入脐带的静脉中,洗除残血,注入口处宜用线绳结扎,以防液体返流.3.用血管钳夹紧脐带一端,从另端向脐静脉中徐徐注入最终浓度为0.1%的胶原酶,待末端出现液体后结扎之,令充满血管,注入口亦应结扎山闹,以防液体返流,消化3~10 分钟.4.吸出含有内皮细胞的消化液,注入离心管中,为获取更多细胞,可再注入温PBS 冲洗2~3 次彻底清除干净残余细胞,一并注入离心管中离心.5.吸除上清,加1640 培养液,制成细胞悬液,接种入瓶皿中培养,顺利时2~3 天内细胞即可长成单层.6)毛细血管内皮细胞培养肿瘤条件培养基制备:1.取C3H 小鼠的S-180 实体肉瘤组织.2.胰蛋白酶消化,Dulbecco 改良Eagle 氏培养液15ml(含10%小牛血清),接种到T-75 Falcon 产培养瓶中培养.3.在细胞生长接近完全汇合时,收集培养液制成条件培养基;再用含10%小牛血清的新培养液后,也每隔两天收集一次,可获得多量条件培养基.4.4000 转/分离心后,再通过0.22μm 微孔滤膜滤过,-20℃冻存备用(临用前融解).初代培养:1.取材:取新鲜牛肾上腺数个,先用Hanks 液洗除血污.2.剥除被膜,分离出皮质,切成1 立方毫米小块,加0.5%胶原酶室温中消化1 小时,每隔10 分钟用吸管吹打悬液令消化充分.3.通过不锈钢纱网滤过,网眼要求只允许能通过小于110 微米长的毛细血管小段.4.650rpm,4℃,离心7 分钟后,弃掉上清胶原酶.5.沉淀物用培养液重悬并离心,再重悬,再离心,共两次.6.末次沉淀物仍用含有10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle 氏培养液重悬后,稍吹打.7.接种于铺有明胶底层的培养皿中,37℃培养,在培养头1~3 小时中,毛细血管小段和内皮细胞最先帖附于底物上,而肾上腺细胞和成纤维细胞却仍在培养液中漂浮.8.趁此时,吸除培养液,再加入肿瘤条件培养液,每两天换液一次.毛细血管小段一般成自1~4 个内皮细胞,以后每个小段在底物上慢慢展成特殊形态的细胞岛,能持续2~5 天.毛细血管内皮细胞分离培养:1.初代培养2~3 天后,镜下确认几个毛细血管内皮细胞岛,在培养皿背面,用不脱色笔划圈圈起.2.镜下检查,如圈内残有非内皮细胞时,可用显微细针在倒置显微镜下挑除.此操作用细胞解剖器或用手操作均可,宜在净化台无菌气流中、打开培养皿盖进行,但时间不宜过长(15~20 分钟),圈内非内皮细胞可用无菌胶刮除.3.用培养液漂洗两次,以去除漂浮细胞.4.剩余内皮细胞岛如小(5~20 个细胞)而少时,生长增值变得缓慢或不完全不生长,此时需加入3T3 等饲细胞,饲细胞接种量为4000 细胞/cm2.5.当内皮细胞充满所有饲细胞空间后,用胰蛋白酶消化、离心、加入肿瘤条件培养基.6.接种入明胶底物皿中继续培养(饲细胞死亡淘汰),细胞增殖生长汇合后,按1:5 传代.

什么叫内皮细胞

内皮细胞:用高倍镜观察肠系膜上的毛细血管,可见到内皮细胞,内皮细胞较间皮细胞小,排列紧密。

内皮细胞或血管内庆汪皮是一薄层的专门上皮细胞,由衫销一层扁平细胞所组成。它形成血管的内壁,是血管管腔内血液及其他血管壁(单层鳞状上皮)的接口。内皮细胞是沿着整个循环系统,由心脏直至最小的微血管。

心室内表面的内皮细或差游胞称为心内膜。微血管及淋巴微管是由单一层

的内皮细胞所组成。

内皮组织是一种特别的上皮组织,而上皮组织是动物的四种生物组织之一。

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