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目录一览：
- 1、单克隆抗体与基因克隆技术相结合
- 2、国内干细胞存储机构排名，如何选择一家靠谱的干细胞存储服务机构
- 3、上海造血干细胞库需要多少基本满足临床需要
- 4、上海莱馥生命科技究竟怎么样？在哪里存干细胞，到底好不好？
单克隆抗体与基因克隆技术相结合
材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞及菌株 HAb18为分泌抗人肝癌mAb的鼠杂交瘤细胞株，由陈志南建株〔4〕；正常肝细胞株QZG引自中国科学院上海细胞库。pCANTAB 5E克隆及表达载体，为Pharmacia公司产品。
1.1.2 试剂 反转录系统为Promega公司产品；PCR引物： heavy chain primer 1和2(Pharmacia公司产品)，分别为重链5′端和3′端引物；light chain primer mix： 为10种轻链5′端和3′端引物的混合物，用来扩增鼠Ig VL基因；linker primer mix，为带有Linker序列(Gly4Ser)3的重链3′端和轻链5′端的引物，用来将VH，VL拼接成ScFv基因；RS primer mix，为带有SfiI位点的重链5′端引物和带有NotI位点的轻链3′端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段并引入酶切位点。引物A，D分别为重链5′端引物(含EcoRI酶切位点)及轻链3′端引物(含SalI酶颂厅切位点)〔5〕。A，D引物的序列如下:
引物A VH-1（正向）:
5′ GTGAATTCATGCAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG 3′
EcoRⅠ
引物D VL-2（反向）:
5′ CAGTCGACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC 3′
SalⅠ
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取、cDNA第1链合成及VH和VL基因的扩增 取对数生长期的HAb18细胞，用异硫氰酸胍变性法，提取细胞总RNA。参照Promega公司反转录系统的产品说明书，反转录合成cDNA第1链。将cDNA第1链合成反应物分为两份，分别加入VH和VL引物各2 μl进行PCR。
1.2.2 ScFv基因的组装 回收的VH和VL基因片段与linker primer mix等摩尔混合，加入dNTP至终浓度为2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶5u，进行7次PCR循环(94℃ 1 min，63℃ 4 min)。将VH和VL基因拼接为ScFv基因。在上述反应体系中，加入RS primer mix，再进行30次PCR循环，可在ScFv基因的两端分别加入SfiI和NotI酶切位点。
1.2.3 ScFv基因的克隆和筛选 上述加端PCR产物经1.8% 琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收后，用SfiI和NotI消化，并与以此两种酶双酶切的pCANTAB 5E噬菌唤樱李粒DNA连接，转化E.coli HB2151，在SOBAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上筛选转化菌。从转化板上挑取单个菌落，用2×YTAG（含100 mg/L氨苄青霉素和2% 葡萄糖的2×YT培养液）于30℃培养过夜，以碱裂解法小量提取噬菌粒DNA，以引物A，D进行PCR扩增出ScFv基因片段，并克隆入pUC19载体。
1.2.4 ScFv核苷酸序列的测定 以美国PE317-A型自动序列分析仪进行序列测定。
1.2.5 可溶性ScFv基因的分泌型表达 将含ScFv基因的重组噬菌粒菌种接种于5 ml LB 培养基，过夜培养。加至50 ml SBAG(含100 mg/L氨苄青霉素和2%葡萄糖的SB培养液)中，30℃振荡培养1 h，5 000 r/min离心15 min，弃上清。将沉淀重悬于50 ml SBAI(含100 mg/L氨苄青霉素和1 mmol/L IPTG的SB培养液)中，37℃诱导3 h，离心同上。取沉淀悬于5 ml新配制的溶菌酶（1 g/L），20% (w/v)蔗糖，30 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)及 1 mmol/L EDTA (pH8.0) 溶液中，冰浴10 min，4℃以12000r/min离心5 min，上清即为外周质部分。将其冷冻干燥后，贮于-20℃。临用时以0.01 mol/L PBS溶解至500 μl。
1.2.6 ScFv基因可溶性表达产物的鉴定 采用SDS-PAGE及Western blot(二抗和迟为鼠抗-E-tag抗体)进行鉴定。
1.2.8 流式细胞仪分析ScFv的活性 收集培养的肝癌细胞SMMC 7721，正常肝细胞QZG及胃癌细胞SCG 7901，用10%FCS RPMI1640调整细胞浓度至5×106/L~1×107/L。每管加入40 μl细胞悬液，100 μl ScFv表达产物，再加入50 μl 1∶20灭活正常兔血清（用DPBS稀释），于4℃作用30 min，洗涤2次，以800 r/min离心5 min，弃上清。加入抗E-tag抗体8 μl(2.5 g/L)，4℃作用30 min，洗涤2次，弃上清。加入50 μl FITC标记的羊抗鼠抗体，充分振摇，4℃作用30 min，洗涤2次，加入500 μl固定液，以流式细胞仪进行分析。同时设正常肝细胞、胃癌细胞为阴性对照组，肝癌细胞加亲本抗体Hab18为阳性对照组。
2 结 果
2.1 VH和VL基因的PCR扩增及ScFv基因的拼接 VH和VL基因测序结果显示，VH为363 bp，VL为342 bp，与预期的VH和VL基因片段大小相符。将VH和VL基因用linker连接成ScFv基因（其中linker为45 bp）。以此为模板加入RS primer mix进行PCR扩增，所获扩增产物的大小约为730 bp，表明VH，VL及linker primer mix的浓度配合准确，并引入了SfiI和NotI酶切位点（图1，见第Ⅳ页）。
2.2 ScFv基因的克隆 将ScFv基因克隆入pCANTAB 5E中，连接物转化E.Coli HB2151。在SOBAG固体培养基上筛选转化的菌落。然后随机挑选8个菌落，小量制备噬菌粒DNA，以Sfi I 和NotI双酶切鉴定。若含有外源插段者，应切出约730 bp大小的片段。结果表明，8个克隆均含插段。
2.3 ScFv基因的序列测定 如图2所示，ScFv基因全长为726 bp，包括预期的VH，VL基因和linker序列。VH基因序列处于linker的上游，VL基因序列处于linker的下游。
2.4 可溶性ScFv蛋白的鉴定 可溶性ScFv-E-tag融合蛋白，预期的Mr为29 000。E-tag可作为蛋白标签，通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达。将阳性克隆以1 mmol/L IPTG诱导3 h，对IPTG诱导和未诱导的菌体进行裂解，经SDS-PAGE后，在(Mr为29 000处多出1条明显的新生蛋白带，与预计的ScFv-E-tag融合蛋白的大小Mr为29 000)相符（图3，见第Ⅳ页）。同时做与图3相同的SDS-PAGE并进行Western blot，在Mr为29 000处有显色条带，即为能与抗E-tag抗体特异性结合的可溶性ScFv蛋白（图4，见第Ⅳ页）。
2.5 可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的结合活性 以可溶性 ScFv蛋白为一抗，抗E-tag抗体为二抗，FITC-抗鼠IgG为三抗，用流式细胞仪测定荧光标记细胞的阳性率(图5，见第Ⅳ页)。肝癌细胞组： 无关抗体(抗-CD3)为1.6%，亲本抗体为97.5%，ScFv 为30.9%；正常肝细胞+ScFv蛋白为2.6%，胃癌细胞+ScFv蛋白 为4.1%。表明可溶性ScFv蛋白能与肝癌细胞特异地结合，而不与正常肝细胞和胃癌细胞结合。荧光显微镜观察，可溶性ScFv蛋白与肝癌细胞的膜抗原相结合，在细胞膜上可见颗粒状的荧光(结果未显示)。
3 讨 论
随着Ig基因结构与功能研究的不断深入，基因工程新技术的不断涌现和成熟，基因工程抗体的研究取得了很大进展。现获得的各种基因工程抗体已基本克服了鼠源性mAb的缺点，及制备人源性抗体的困难，使之在基础医学研究和临床疾病的诊断、治疗和预防等领域，特别是肿瘤的治疗中，得到了极为广泛地应用，有的已进入Ⅲ期临床应用。运用基因工程重组技术，将鼠源性抗体恒定区和可变区的框架区以人源性相应抗体片段取代，可降低抗体的免疫原性，有效地减轻免疫排斥反应〔6〕。利用基因突变技术改变抗体的某些结构，则可提高抗体的亲和力，延长其半衰期〔7〕。另外，还可将抗体基因与其它功能性基因相连接，赋予抗体新的功能。
近年发展起来的抗体库克隆技术，可无需进行细胞融合制备杂交瘤，甚至无需进行免疫，即可直接从基因水平上，获得所需的针对相应抗原的抗体。制备基因工程抗体的关键，是获得抗体可变区基因，拼接成单链抗体基因，并表达出有生物学活性的产物。
本文从分泌抗肝癌mAb的杂交瘤细胞(HAb18)中，用RT-PCR，克隆出抗体可变区基因，其关键是PCR引物的设计。大多数研究者设计合成的引物，通常是针对V区FR1 5′端（或信号肽）的保守序列和J基因3′端序列（或恒定区基因序列）而设计的，特异性不够强，不能有效地扩增某些目的基因。Pharmacia公司噬菌体呈现系统中的混合引物，系针对鼠Ig基因不同家族的序列而设计的。从理论上讲，适用于所有类型的Ig，每种可变区基因都可获得扩增，对全套抗体库的构建非常重要。
本研究所用pCANTAB 5E是Pharmacia公司的产品，含有氨苄青霉素抗性基因，plac启动子和M13噬菌体基因间隔区片段，在多克隆位点与gⅢ编码区之间，有1个c-myc tag序列和琥珀终止码TAG，IPTG可诱导外源基因的表达。在不含有琥珀抑制基因的菌株（如HB2151）中，E-tag后的终止码被识别，多肽链的翻译终止于此，从而可生成具
有生物学活性带有13肽E-tag的可溶性ScFv蛋白，释放于细菌周质中。E-tag为源于人c-myc基因的一段序列，对ScFv基因的结构和活性均无影响，可作为可溶性ScFv蛋白的标签，用抗E-tag抗体来检测ScFv基因的表达并纯化其产物。我们用含有ScFv基因的重组噬菌粒载体转化大肠杆菌HB2151，经IPTG诱导获得可溶性表达产物。用抗E-tag抗体做Western blot证实，表达产物为ScFv-E-tag融合蛋白。流式细胞仪分析表明，此ScFv融合蛋白可与肝癌细胞结合，荧光标记细胞的阳性率为30.9%，而不与正常肝细胞及胃癌细胞相结合，表明此ScFv蛋白具有肝癌结合的特异性。
参考文献
1 顾方舟，陈妙兰，陆如山等. 肝癌研究概况与展望. 北京： 中国协和医科大学，北京医科大学联合出版社，1993: 1-3
2 Hoston JS，Levinson D，Mudgett HM et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in E.coli. Proc Natl Acad Sci USA，1988；85: 5879-5883
3 Kroesen BJ，Wellenberg GJ，Bakker A et al. The role of apoptosis in bispecific antibody-mediated T cell cytotoxicity. Br J Cancer，1996 ；73(6): 721-727
4 陈志南，刘彦仿，杨继震等. 抗人肝细胞癌单克隆抗体的产生及其相应抗原的免疫组化定位研究. 单克隆抗体通讯，1989；5(2)： 33-36
5 杨安钢，吉昌华，韩 骅等. 抗人CD8单抗κ轻链可变区基因的克隆和序列测定. 生物化学与生物物理进展，1992；19（4）： 286-288
6 Man SC，Jeanne BK，Bednarik EJ. Humanized anti-Lewis Y antibodies: in vitro properties and pharmacokinetics in rhesus monkeys. Cancer Research，1996；56: 1118-1125
7 Mats O，Henrik O，Michael M et al. Light chain shuffling of a high affinity antibody results in a drift in epitope recognition. Mol Immunol，1996；33(1): 47-56
(收稿 1998-03-03 修回 1998-03-26)
国内干细胞存储机构排名，如何选择一家靠谱的干细胞存储服务机构
上海最大的就是华夏源。包括新生儿存储，自体脂肪、牙髓衫困和免疫细胞存储，涵盖了现在最主流的项目。既可以在宝宝出生的时候给他存，也可以存自己的或腔念干圆猛细胞，一人存储，全家受益。希望可以帮到您。
上海造血干细胞库需要多少基本满足临床需要
听说有10万个样本以上才能基本满足临床需求。现在台湾的中华骨髓库已经达到了这个数字。
上海莱馥生命科技究竟怎么样？在哪里存干细胞，到底好不好？
这家公司我还真知道，它在圈里还是比较有名的，它不但码基在三甲医院里建立了六位一体的干细胞工搏尺程转化医学中心，也是上海区域细胞存储、制备、检测中心，是国家卫计委和CFDA首批认定的干细胞临床研究机构之一。 如基模高果想存干细胞，我还是觉得哪里比较靠谱，别问地方我不知道，但，那还是很有实力的，
【总结】关于“上海细胞所细胞库？细胞是遗传细胞库”的解读完毕，干细胞治疗，免疫细胞存储找细胞健康网，细胞是遗传细胞库更多细胞资讯 https://yszxyy.com/
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