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目录一览：
- 1、RNA甲基化专题 | 癌症研究篇
- 2、有没有做过hk-2细胞转染得分
- 3、糖酵解与肿瘤如此紧密相关，不可不知
- 4、如何区分尿沉渣镜检中的白细胞与肾小管上皮细胞
- 5、hk2（人肾小管上皮细胞细胞）用什么培养基
RNA甲基化专题 | 癌症研究篇
m6A RNA甲基化是最常见、最丰富的真核生物mRNA转录后修饰。研究表明，m6A 在不同组织，细胞系中是一个复杂的调控网路，m6A RNA 甲基化参与 RNA 的代谢过程，并与肿瘤的发生和发展密切相关。本期着重解读两篇癌症中的 m6A 研究，看一下 m6A RNA 甲基化如何玩转高分期刊。
2020年10月，南京医科大学汪秀星课题组和美国 UCSD Jeremy Rich 等课题组在Cancer Discovery上发表题为“The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells”的研究论文。该研究为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。
研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）代表了最常见的原发性，内在性脑肿瘤，患者的平均生存期限制在一年以上。鉴于胶质母细胞瘤干细胞（GSC）在治疗抗性，血管生成，免疫逃逸和侵袭中的作用，临床和临床前观察表明，靶卖派向GSC可以改善肿瘤预后神经肿瘤学上的精准医学研究。
研究方法
研究结果
1. 在 GSC 中上调的致癌转录本以 RNA m6A 修饰为标志
作者利用 MeRIP-seq 对 GSC 和神经干细胞（NSC）进行 m6A 标记的检测，结果发现，与非肿瘤对应物相比，GSCs 的m6A 分布发生了改变。通过38个 GSCs 和5个 NSCs 的队列中的 RNA-seq 数据进行 GSEA 分析，具有 m6A 峰的基因在GSC 高度富集，而且在 GSC 中获得的具有 m6A 峰的基因均被上调。相反，相对于 NSC、GSC 中丢失 m6A 峰的基因通常在 GSC 中被下调。而且，在 GSC 中，与癌症干细胞相关的重要基因上获得了 m6A 峰，包括表达增加的 OLIG2 和 MYC 。
2. YTHDF2 在 GSC 中表达上调，对 GSC 的维持至关重要
作者为研究 m6A YTHDF 在胶质母细胞瘤中的功能作用，利用 CRIPR 技术检测了 YTHDF2 ，相对于对照 sgRNA，敲除 YTHDF2 会降低细胞活力及减少 GSCs 中细胞球形成。为研究了 YTHDF2 耗竭是否会诱导 GSC 分化，正交实验发现，shRNA 介导的 YTHDF2 敲低会降低 GSC 的活性，过表达的 YTHDF2 可以挽救 GSC 的活性。结果表明， YTHDF2 是胶质母细胞瘤维持的一个特异性和有效的调节因子。
3. YTHDF2 通过 m6A RNA 修饰支持 GSCs 中的基因表达
作者利用 RNA-seq 检测 YTHDF2 的下游靶点，敲除 YTHDF2 可引起 GSCs 中广泛基因表达的改变， MYC 靶点显著富集，而且，GSCs 中获得 m6A 峰的基因更频繁地下调。通过 qPCR 也验证了 YTHDF2 敲除对 MYC、VEGFA mRNA 水平降低的作用。为了预测 YTHDF2 在 GSCs 中的作用携没，作者结合 TCGA 胶质母细胞瘤基因表达数据，发现 YTHDF2 相关基因 MYC 和 E2F 靶点以及 G2M 调节因子和氧化磷酸化介质高度富集。这些数据表明 YTHDF2 作为与 m6A 差异修饰相关的转录程序的调节因子。
4. YTHDF2 通过保持 MYC 转录稳定发挥 GSC 特异性依赖作用辩配纳
为了确定 YTHDF2 介导作用于 GSCs 中 MYC 的特异性，作者比较了在 NSCs 和 GSCs 之间 YTHDF2 缺失的影响。NSCs 中 YTHDF2 敲低并不影响 MYC mRNA 水平，但降低了 GSCs 中 MYC mRNA 水平。而且， YTHDF2 耗竭降低了GSC 的活性，而不影响 NSCs。因此， YTHDF2 代表了一种 GSC 特异性依赖，通过 MYC 基因的特异性稳定支持胶质母细胞瘤的生存。
5. IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 轴的下游靶点
因为 IGFBP3 是 YTHDF2 耗尽后最高下调基因之一，作者研究了 IGFBP3 是否调控 YTHDF2-MYC 轴下游的细胞活力。 IGFBP3 的缺失降低了 GSC 的活性和细胞球形成。 IGFBP3 过表达挽救了 GSCs 免于 YTHDF2 下调介导的细胞死亡。最后，作者利用20个胶质母细胞瘤和20个非肿瘤脑组织中 IGFBP3 的表达进行验证，观察到 GSC 中 IGFBP3 mRNA 表达升高。结果表明， IGFBP3 是 GSCs 中 YTHDF2-MYC 信号轴的关键下游效应子。
6. YTHDF2-MYC-IGFBP3 轴促进体内肿瘤生长
为了探讨在体内靶向 YTHDF2 治疗的潜在益处，作者利用 CRISPR 敲除技术对原位异种移植物的小鼠进行检测。结果表明，与携带对照 sgRNA 的 GSCs 的小鼠相比，敲除 YTHDF2 延长了肿瘤潜伏期并减少了肿瘤体积。 IGFBP3 过 表达恢复了 YTHDF2 缺失的 GSCs 体内成瘤能力。
研究结论
通过结合体外和体内的 GSCs 研究，该研究阐明了 m6A 介质在 GSCs 中的功能，并确定 YTHDF2 是 GSCs 特异性依赖，通过稳定 MYC 转录物调控 GSCs 中的葡萄糖代谢。这些发现为靶向治疗胶质母细胞瘤提供了新的治疗机会。
2020年4月，上海交通大学医学院附属仁济医院洪洁团队在 Molecular Cancer 上发表了题为“m6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression”的研究论文。研究表明，靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。
研究背景
结直肠癌 (CRC) 是全球第四大常见恶性肿瘤和第三大癌症死亡原因，而以乳酸作为糖酵解的最终产物，被认为是治疗癌症的一种有前途的方法。m6A 调控基因的改变在多种人类疾病的发病机制中起着重要的作用，但 m6A 修饰是否在 CRC 的葡萄糖代谢中起作用尚不清楚。
研究方法
研究结果
1. METTL3 与结直肠癌糖酵解密切相关
为了探讨结直肠癌（CRC）中 m6A 修饰与糖酵解代谢之间的相关性，作者对47例 CRC 患者进行 RT-PCR分析，CRC患者中FDG 摄取与 METTL3 表达之间存在最显着的相关性。进一步分析发现 CRC 患者中 FDG 摄取与 METTL3 免疫组化染色存在显著相关性。最后，作者利用 RNA-seq 比较 METTL 3 敲除和野生型(WT) HCT116 CRC 细胞的基因表达谱， METTL3 敲除细胞表现出更高的 METTL3 表达。这些结果表明 METTL3 可能介导 CRC 患者糖溶解代谢和癌变。
2. METTL3 在结直肠癌中促进糖酵解代谢
为了弄清 METTL3 的改变是否直接影响糖酵解代谢，研究发现敲除 METTL3 可显著降低 HCT116 和 SW480 细胞的胞外酸化速率(ECAR)水平，过表达 METTL3 显著提高了 DLD1 细胞的乳酸生成、葡萄糖吸收和 ECAR 水平。为了阐明 Mettl3 诱导的 CRC 糖酵解是否依赖于其甲基转移酶功能，作者通过 Mettl3 野生型和突变型的研究，发现 Mettl3 的 MTase 结构域的缺失阻断了 Mettl3 诱导的糖酵解过程。这些数据表明 Mettl3 通过其甲基转移酶结构域调控结直肠癌糖酵解代谢。
3. 在结直肠癌中， METLC3 诱导的增殖依赖于糖酵解的激活
METLC3 的敲除消除了 HCT116 细胞的细胞增殖和集落形成，并且降低了 HCT116 肿瘤的生长和异种移植小鼠模型中的肿瘤重量。在功能分析中， METTL3 的过表达增加细胞增殖、集落形成、肿瘤的生长和肿瘤的重量。2-DG（糖酵解途径的抑制剂）处理在体外和体内显着阻断了 METTL3 诱导的细胞增殖和菌落形成，这些结果表明 Mettl3 通过调控结直肠癌糖代谢促进 CRC 进展。
4. METTL3 在结直肠癌中的潜在靶点
为了鉴定 METTL 3 的潜在靶标，作者选择了 METTL3 敲除和 WT HCT116 细胞进行 MeRIP-seq和RNA-seq，最常见的motif ' GGAC '在 m6a 峰中显著富集，大部 分 METTL3 结合位点位于 CDS区，在 5'UTR 和 3'UTR 高度富集，并且 m6A在转录水平上发生了全局低甲基化。联合RNA-seq数据，确定了429个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被下调，595个低甲基化的 m6A 基因，其 mRNA 转录被上调。基于甲基化水平与 mRNA 表达水平都下降，找到与糖酵解密切相关的靶基因 HK2 和 SLC2A1(GLUT1) 。
6. HK2 和 SLC2A1 是 METTL3 在 CRC 中重要的功能靶基因
作者通过 HCT116 WT 和 mettl3 敲除细胞转染 control、 HK2 或 SLC2A1 过表达实验发现， HK2 或 SLC2A1 的异位表达部分恢复了敲除 mettl3 细胞的增殖、集落形成能力和肿瘤生长，而且，也能恢复 HCT116 mettl3 敲除细胞中乳酸产量的下降。同时，在体外和体内，过表达 SLC2A1 显著恢复了 HCT116 mettl3 敲除细胞葡萄糖摄取下降的趋势。因此， HK2 和 SLC2A1 介导了 CRC 细胞中 METLL3 的调节功能。
研究结论
METTL3 是 CRC 的一种功能性和临床致癌基因。 METTL3 通过 m6A- IGF2BP2/3— 依赖机制稳定 CRC 中 HK2 和 SLC2A1 的表达。靶向 METTL3 及其通路为高糖代谢的 CRC 患者提供了另一种合理的治疗靶点。
参考文献
[1] Dixit D, Prager B, GimpleShen R, et al. The RNA m6A reader YTHDF2 maintains oncogene expression and is a targetable dependency in glioblastoma stem cells[J]. Cancer Discovery, 2020.
[2] Shen C, Xuan B, Yan T, et al. M6A-dependent glycolysis enhances colorectal cancer progression[J]. Molecular Cancer, 2020, 19(1).
有没有做过hk-2细胞转染得分
hk2细胞转染
转染步骤 仅供参考
实验步骤设计用来进行24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染，其为设计用来在生长培养基中直接加入复合物。
转染前一天胰酶消化细胞并计数，细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常型做生长的培养基中。
对陵租数于每孔细胞，使用50ul无血清培养基稀释1.0ug DNA。多孔操作可以批量制备。
对于每孔细胞，使用50ul OPTI MEM I 培养基稀释2ul LIPOFECTAMINE 2000试剂。稀释后在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。
混合稀释的DNA和稀释的LIPOFECTAMINE 2000。在室温保温20分钟。
直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
在37度，百分之5的CO2中尺首保温24到48小时
在hk2细胞中加入复合物72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。
糖酵解与肿瘤如此紧密相关，不可不知
癌症在全球范围内发病率和致死率高，已经严重威胁到人类的健康。癌症危害之大且难以攻克，源于其自身恶性肿瘤细胞所有的特征，即自给自足生长信号、抗生长信号的不敏感、抵抗细胞死亡、潜力无限的复制能力、持续的血管生成、组织浸润和转移、避免免疫摧毁、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常、基因组不稳定和突变共计十大特征。其中能量异常受到越来越多的关注，成为肿瘤治疗的新靶点。
正常细胞体内，葡萄糖会维持一个平衡状态，在缺氧状态时，葡萄糖会转变丙酮酸进而转变为乳酸，当氧含量正常时，丙酮酸会进入三羧酸（TCA）循环。而肿瘤细胞的一个普遍特点是即使在氧含量正常的情况下，葡萄糖摄取量和乳酸的积累量也会逐渐升高，利用糖酵解作为主要能量代谢的来源，获得更高的糖分解能力，使得葡萄糖转变为乳酸来产生ATP，这种现象我们称为Warburg效应。
Warburg效应代表着肿瘤细胞对葡萄糖利用方式由氧化磷酸化到糖酵解的转变，现在被认为是肿瘤一大特征。这种能量代谢的改变受复杂因素的调控，包括肿瘤微环境的压力和基因的改变等。肿瘤细胞糖酵解增强主要是由于糖酵解关键酶和乱巧的表达或者活唤键性增强。近年来，人们正在探求通过抑制肿瘤糖酵解通路关键酶的活性来靶向治疗肿瘤。一些研究显示，抑制肿瘤糖酵解途径能够有效抑制肿瘤细胞的增殖甚至可以起到杀伤肿瘤细胞的作用。已糖激酶2（HK2）、磷酸果糖酶（PFK）、M2型丙酮激酶（PKM2）等糖酵解关键酶已经成为肿瘤标志物，它们的表达与活性可以影响肿瘤的糖酵解，进而影响肿瘤的增殖。
肿瘤高表达HK2的原因仍不是很清楚，但很多肿瘤特别依赖HK2的现象表明，当对肿瘤细胞使用HK2选择性抑制剂时，肿瘤细胞几乎不会通过重新表达其他亚型来逃避抑制。氯尼达明是由意大利Angelini公司开发的一种选择性HK2抑制剂，目前用于肺癌、前列腺癌、乳腺癌和宫颈癌的治疗。
PFK2的亚型PFKFB3在很多癌症中都有表达，并且PFKFB3几乎没有磷酸酶的活性。它的激酶活性受到控制癌症代谢的调控因子影响，如调节代谢水平的RAS和磷酸腺苷激活蛋白激酶等信号陪念通路。有文献报道PFKFB3的小分子抑制剂能够抑制RAS突变的癌细胞生长。动物实验也发现靶向抑制PFKFB3的化合物能够降低F-2,6-BP的水平，并减缓移植瘤的生长，因此以该酶为靶点开发癌症的治疗药物越来越受到人们的关注。
PK是另一种有可能成为靶点的具有亚型选择性的糖酵解酶，所有肿瘤细胞都表达PKM2。PKM2能够促进有氧糖酵解，研究也发现在小鼠移植瘤生长过程中PKM2也是高选择性表达。研究发现一些多肽配体能够选择性抑制PKM2，并促使生成低活性丙酮酸激酶，从而导致能量应激和培养的肿瘤细胞死亡。TT-232（CAP-232）是由Thallion Pharmaceuticals公司开发的以PKM2为靶点的抑制剂，有望用于多种实体瘤的治疗。
肿瘤细胞能量代谢较正常细胞发生了异常，是一个复杂的过程，尤其糖代谢过程虽然已经有了大量研究，但是其中各关键点依然还有很多疑问亟待解决。此外，糖酵解酶的活性可能会受肿瘤微环境的影响而产生变化，对单一靶点的抑制可能不足以抑制肿瘤增殖，甚至可能引起耐药性，对多个糖酵解酶靶点的联合治疗值得特别重视。
糖酵解与肿瘤如此紧密相关，不可不知
如何区分尿沉渣镜检中的白细胞与肾小管上皮细胞
研究肾小管上皮细胞IL-4受体和IL-13受体的表达及IL-4和IL-13对肾小管上皮细胞形态和功能的影响,并探讨其作用机制。方法:借助人近端肾小管上皮细胞系(HK2),采用RT-PCR,免疫荧光方法检测HK2上IL-4受体和IL-13受体的表达。免疫荧光方法观察不同浓度IL-4和IL-13干预HK2细胞12～48h后HK2损伤标志物RANTES的变化情况。Western blot方法检测IL-4和IL-13干预HK2细胞谈宴缺后,JAK-STAT6信号通路的活化以及JAK-STAT6信号通路特异性抑制剂来氟米特对IL-4和IL-13作用HK2细胞的影响。结果:(1)RT-PCR和免疫荧光结果显示HK2有IL-4II型受体和IL-13I型受体mRNA和蛋白质表达。(2)IL-4和IL-13呈时间-剂量依赖性影响上皮细胞RANTES的表达。100ng/mlIL-4、50ng/mlIL-13作用48h对HK2的损伤作用最为明显。正常HK2细胞RANTES呈阴性,100ng/mlIL-4和50ng/mlIL-13干预48h后,阳性细胞显著增多。(3)Western blot方法结果显示JAK-STAT6磷酸化水平均在IL-4和IL-1350ng/ml作用10min时开始升高,IL-4100ng/ml作用20min达高峰,IL-1350ng/ml20min达高峰。JAK-STAT6信号通路特异性抑制剂来氟米特可阻断JAK-STAT6信号通路的活化,拮抗IL-4和IL-13诱导的祥稿HK2细胞RANTES表达。结论:(1)本研究首次证实人近端肾小管上皮细胞存在IL-4和IL-13受体的表达。(2)IL-4和IL-13可通含辩过人近端肾小管上皮细胞上的相应受体造成细胞损伤,表现为RANTES表达增加。(3)IL-4和IL-13的上述作用与细胞内JAK-STAT6信号通路活化密切相关。
hk2（人肾小管上皮细胞细胞）用什么培养基
hk2（人肾小管上皮细胞细胞）用什么培养基
培养液:用含10%胎牛血清的DMEM培养基，PH值7.2－7.4，新鲜配制的橘瞎不用加谷氨酰胺，超过2周后加入1ML／100ML培养基。如果长得不好,可以提高胎牛血清的浓度到20%左右,培养瓶最好用添加EGF的明胶或胶原裱衬，浓度一般是1－3mg/ml,不用也行,有的人也添加VEGF，浓度一般是10-50ng/圆凳空ml,常规粗缓加碳酸氢钠和双抗。在37℃、体积分数5% CO2的条件下培养.
细胞贴壁生长，胰酶每2～4d传代1次.也有用M199培养基的.其他一样.（仅供参考）
【总结】关于“hk2细胞是什么细胞？hk细胞百科”的解读完毕，干细胞治疗，免疫细胞存储找细胞健康网，hk细胞百科更多细胞资讯看 https://yszxyy.com/
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