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目录一览：
- 1、化学考研考什么专业啊
- 2、南海北部陆坡神狐海域HS-岩心表层沉积物古菌多样性
- 3、处理离体小瓜虫对照组用什么
- 4、求助：化学修饰电极电催化
- 5、考研我想调剂建筑学，往年都有哪些比较好一点的学校可以调剂的
化学考研考什么专业啊
武汉大学 它的分析化学专业比较好，但可能不好考
四川大学 有机化学专业较好
世界精细化工总体发展现状及趋势
精细化工是当今化学工业中最具活力的新兴领域之一，是新材料的重要组成部分。精细化工产品种类多、附加值高、用途广、产业关联度大，直接服务于国民经济的诸多行业和高新技术产业的各个领域。大力发展精细化工已成为世界各国调整化学工业结构、提升化学工业产业能级和扩大经济效益的战略重点。精细化工率(精细化工产值占化工总产值的比例)的高低已经成为衡量一个国家或地区化学工业发达程返悄启度和化工科技水平高低的重要标志。
一、世界精细化工总体发展态势
综观近20多年来世界化工发展历程，各国、尤其是美国、欧洲、日本等化学工业发达国家及其著名的跨国化工公司，都十分重视发展精细化工，把精细化工作为调整化工产业结构、提高产品附加值、增强国际竞争力的有效举措，世界精细化工呈现快速发展态势，产业集中度进漏如一步提高。进入21世纪，世界精细化工发展的显著特征是：产业集群化，工艺清洁化、节能化，产品多样化、专用化、高性能化。
1、精细化学品销售收入快速增长，精细化率不断提高
上世纪九十年代以来，基于世界高度发达的石油化工向深加工发展和高新技术的蓬勃兴起，世界精细化工得到前所未有的快速发展，其增长速度明显高于整个化学工业的发展。近几年，全世界化工产品年总销售额约为1.5万亿美元，其中精细化学品和专用化学品约为3800亿美元，年均增长率在5～6%，高于化学工业2～3个百分点。预计至2010年，全球精细化学品市场仍将以6%的年均速度增长。2008年，世界精细化学品市场规模将达到4500亿美元。目前，世运枯界精细化学品品种已超过10万种。精细化率是衡量一个国家和地区化学工业技术水平的重要标志。美国、西欧和日本等化学工业发达国家，其精细化工也最为发达，代表了当今世界精细化工的发展水平。目前，这些国家的精细化率已达到60～70%。近几年，美国精细化学品年销售额约为1250亿美元，居世界首位，欧洲约为1000亿美元，日本约为600亿美元，名列第三。三者合计约占世界总销售额的75%以上。
2、加强技术创新，调整和优化精细化工产品结构
加强技术创新，调整和优化精细化工产品结构，重点开发高性能化、专用化、绿色化产品，已成为当前世界精细化工发展的重要特征，也是今后世界精细化工发展的重点方向。
以精细化工发达的日本为例，技术创新对精细化学品的发展起到至关重要的作用。过去10年中，日本合成染料和传统精细化学品市场缩减了一半，取而代之的是大量开发功能性、绿色化等高端精细化学品，从而大大提升了精细化工的产业能级和经济效益。例如，重点开发用于半导体和平板显示器等电子领域的功能性精细化学品，使日本在信息记录和显示材料等高端产品领域建立了主导地位。在催化剂方面，随着环保法规日趋严格，为适应无硫汽油等环境友好燃料的需要，日本积极开发新型环保型催化剂。目前超深脱硫催化剂等高性能催化剂在日本催化剂工业中已占有相当高的份额，脱硫能力从低于50μg/g提高至低于10μg/g，由此也促进了催化剂工业的整体发展。2004年日本用于深度脱硫等加氢工艺的炼油催化剂产量比上年同期增长了近60%，销售额增长了43%。与此同时，用于石油化学品和汽车尾气净化的催化剂销售额也以两位数的速度增长，已占催化剂市场半壁江山。日本催化剂生产和销售去年分别增长了7%和5%，打破了近六年来的记录。
3、联合兼并重组，增强核心竞争力
许多知名的公司通过兼并、收购或重组，调整经营结构，退出没有竞争力的行业，发挥自己的专长和优势，加大对有竞争力行业的投入,重点发展具有优势的精细化学品，以巩固和扩大市场份额，提高经济效益和国际竞争力。例如，2005年7月，世界著名橡胶助剂生产商——美国康普顿公司(Crompton)花20亿美元收购了大湖化学公司后成立名为“科聚亚”公司(Chemturags)，成为继鲁姆哈斯和安格公司后的美国第三大精细化工公司和全球最大的塑料添加剂生产商。新公司的产品包括了塑料添加剂、石化添加剂、阻燃剂、有机金属、聚氨酯、泳池及温泉维护产品及农业化学品，在高价值产品的市场上具有领导地位，其精细化工的年销售额可达到37亿美元。
又如，德固赛和美国塞拉尼斯各出资50%合并羰基合成产品，在欧洲建立丙烯—羰基合成产品生产基地。合并后，羰基合成醇年产量将达到80万吨——占欧洲市场份额的三分之一。与此同时，德固萨公司以6.7亿美元价格将其食品添加剂业务出售给嘉吉公司(Cargill)。从而使嘉吉公司成为食品添加剂行业的领先者，能向全球的食品及饮料公司提供各种专用添加剂。再如，总部位于荷兰海尔伦的皇家帝斯曼公司(DSM)，2003年2月以19.5亿欧元的代价，收购了罗氏全球的维生素、胡萝卜素和精细化工业务，成为世界维生素之王。2004年全球销售额80亿欧元(约为100亿美元)。
二、我国精细化工发展现状与趋势
近十多年来，我国十分重视精细化工的发展，把精细化工、特别是新领域精细化工作为化学工业发展的战略重点之一和新材料的重要组成部分，列入多项国家计划中，从政策和资金上予以重点支持。目前，精细化工业已成为我国化学工业中一个重要的独立分支和新的经济效益增长点。
我国近期出台的《“十一五”化学工业科技发展纲要》又将精细化工列为“十一五”期间优先发展的六大领域之一，并将功能涂料及水性涂料，染料新品种及其产业化技术，重要化工中间体绿色合成技术及新品种，电子化学品，高性能水处理化学品，造纸化学品，油田化学品，功能型食品添加剂，高性能环保型阻燃剂，表面活性剂，高性能橡塑助剂等列为“十一五”精细化工技术开发和产业化的重点。可以预见，随着我国石油化工的蓬勃发展和化学工业由粗放型向精细化方向发展，以及高新技术的广泛应用，我国精细化工自主创新能力和产业技术能级将得到显著提高，成为世界精细化学品生产和消费大国。
1、精细化工取得长足进步，部分产品居世界领先地位我国精细化工的快速发展，不仅基本满足了国民经济发展的需要，而且部分精细化工产品，还具有一定的国际竞争能力，成为世界上重要的精细化工原料及中间体的加工地与出口地，精细化工产品已被广泛应用到国民经济的各个领域和人民日常生活中。统计表明，目前我国精细化工门类已达25个，品种达3万多种，已建成精细化工技术开发中心10个，精细化学品生产能力近1350万吨/年，年总产量近970万吨，年产值超过1000亿元。2004年，我国精细化工率已上升到45%。
近年来，我国的染料产量已跃居世界首位，2004年，染料产量达到了59.83万吨，约占世界染料产量的60%。目前已能生产的品种超过1200个，其中常年生产的品种约700个。我国不仅是世界第一染料生产大国，而且是世界第一染料出口大国，染料出口量居世界第一，约占世界染料贸易量的25%，已成为世界染料生产、贸易的中心，在世界染料市场占有显著地位，2004年出口量达到22.66万吨。涂料产量2004年达到298万吨，比2000年净增104万吨，成为世界第二大涂料生产国。农药产量居世界第二位。柠檬酸的年出口量已接近40万吨，约占全球总消费量的三分之一；维生素C的出口量已突破5万吨，占全球总消费量的50%以上。
2、建设精细化工园区，推进产业集聚
近几年，许多省市都把建设精细化工园区，作为调整地方化工产业布局、提升产业、发展新材料产业、推进集聚的重要举措。据报道，目前全国已建和在建的精细化工园区至少有15个。
例如，浙江上虞精细化工园区规划总面积20平方公里，自1999年1月正式启动以来，共引进来自10个国家、地区和10个省市的项目80多个，资金逾25亿元。到2004年9月已经有140余家精细化工企业入驻，其中年销售收入在500万以上的规模企业有53家，并形成了以染料(颜料)、生物医药及中间体和专用化学品为主要门类的精细化工产业。2003年上虞精细化工产业实现销售收入119.5亿元、利税22.6亿元，出口创汇1.75亿元。基地提出了6年后培育20家高新技术企业，实现技工贸收入300亿元的目标。该园区已被科技部认定为国家火炬计划上虞精细化工特色产业基地。
又如，中国精细化工(常州)开发园区，已形成精细化工为特色，通达上下游多个领域的化工生产和仓储基地。到2003年9月，已累计投资近200亿元，有72家化工企业落户，其中有世界500强中的美国亚什兰化学公司、日本普利司通轮胎公司和韩国现代公司等知名企业。
3、跨国公司加速来华投资，有力推动精细化工发展
跨入21世纪以来，随着经济全球化趋势快速发展，以及我国民经济持续稳步快速发展对精细化学品和特种化学品强大市场需求，吸引了诸多世界著名跨国公司纷纷来我国投资精细化工行业，投资领域涉及精细化工原料和中间体、催化剂、油品添加剂、塑料和橡胶助剂、纺织/皮革化学品、电子化学品、涂料和胶粘剂、发泡剂和制冷剂替代品、食品和饲料添加剂以及医药等，从而有力地推动我国精细化工产业的发展。
例如，世界著名的精细化学品生产商、德国第3大化学品公司德固赛公司看好中国专用化学品市场，1998年以来，德固萨公司已在我国南京、广州、上海、青岛、天津和北京等11个地区建有18家生产厂，2004年实现营业额达到3亿欧元。为了扩大中国市场，并成为中国特种化工领域的领跑者，德古萨去年在上海成立了研发中心，为中国乃至亚洲市场研发专用产品。
又如，世界10大涂料公司已全部进入我国，迄今为止独资和合资建筑涂料厂约16家，生产规模都在2～5万吨/年。
近两年来立邦公司投资41亿日元使廊坊公司和苏州公司的生产能力各扩建为16万吨，上海扩建为14万吨，广州为7万吨，全部项目2005年竣工投产，届时立邦将占中国19%的市场份额。以生产不含铅、汞等有毒有害成分涂料著称的ICI公司声称要在中国市场的争夺中超越立邦成为第一。ICI和立邦的产品销售额现占中国市场的30%。
用于生命科学的电化学技术
由于生命现象与电化学过程密切相关,因此电化学方法在生命科学中得到广泛应用,其内容非常丰富,主要有电脉冲基因直接导入、电场加速作物生长、癌症的电化学疗法、电化学控制药物释放、在体研究的电化学方法、生物分子的电化学行为等。本节简单地介绍一下这些用于生命科学的电化学技术。
电脉冲基因直接导入是基于带负电的质粒DNA或基因片断在高压脉冲电场的作用下被加速“射”向受体细胞,同时在电场作用下细胞膜的渗透率增加(介电击穿效应),使基因能顺利导入受体细胞。由于细胞膜的电击穿的可逆性,除去电场,细胞膜及其所有的功能都能恢复。此法已在分子生物学中得到应用。细胞转化效率高,可达每微克DNA1010个转化体,是用化学方法制备的感受态细胞的转化率的10～20倍。
电场加速作物生长是很新的研究课题。Matsuzaki等报道过玉米和大豆苗在含0 5mmol/LK2SO4培养液中培养,同时加上20Hz,3V或4V(峰 峰)的电脉冲,6天后与对照组相比,秧苗根须发达,生长明显加速。据称其原因可能是电场激励了生长代谢的离子泵作用。
癌症的电化学疗法是瑞典放射医学家Nordenstrom开创的治疗癌症的新方法。其原理是:在直流电场作用下,引起癌灶内一系列生化变化,使其组织代谢发生紊乱,蛋白质变性、沉淀坏死,导致癌细胞破灭。一般是将铂电极正极置于癌灶中心部位,周围扎上1～5根铂电极作负极,加上6～10V的电压,控制电流为30～100mA,治疗时间2～6小时,电量为每厘米直径癌灶100～150库仑。此疗法已在推广用于肝癌、皮肤癌等的治疗。对体表肿瘤的治疗尤为简便、有效。
控制药物释放技术是指在一定时间内控制药物的释放速度、释放地点,以获得最佳药效,同时缓慢释放有利于降低药物毒性。电化学控制药物释放是一种新的释放药物的方法,这种方法是把药物分子或离子结合到聚合物载体上,使聚合物载体固定在电极表面,构成化学修饰电极,再通过控制电极的氧化还原过程使药物分子或离子释放到溶液中。药物在载体聚合物上的负载方式分为共价键合型和离子键合型负载两类。共价键合负载是通过化学合成将药物分子以共价键方式键合到聚合物骨架上,然后利用涂层法将聚合物固定在固体电极表面形成聚合物膜修饰电极,在氧化或还原过程中药物分子与聚合物之间的共价键断裂,使得药物分子从膜中释放出来。离子键合负载是利用电活性导电聚合物如聚吡咯、聚苯胺等在氧化或还原过程中伴随有作为平衡离子的对离子的嵌入将药物离子负载到聚合物膜中,再通过还原或氧化使药物离子从膜中释放出来。
在体研究是生理学研究的重要方法,其目的在于从整体水平上认识细胞、组织、器官的功能机制及其生理活动规律。由于一些神经活性物质(神经递质)具有电化学活性,因此电化学方法首先被用于脑神经系统的在体研究。当采用微电极插入动物脑内进行活体伏安法测定获得成功后,立即引起了人们的极大兴趣[1]。该技术经过不断的改善,被公认为在正常生理状态下跟踪监测动物大脑神经活动最有效的方法。通常可检测的神经递质有多巴胺、去甲肾上腺素、5 羟色胺及其代谢产物。微电极伏安法成为连续监测进入细胞间液中原生性神经递质的有力工具。在体研究一般采用快速循环伏安法(每秒上千伏)和快速计时安培法。快速循环伏安法还被用于研究单个神经细胞神经递质释放的研究,发展成为所谓的“细胞电化学”。
生物分子的电化学行为的研究是生物电化学的一个基础研究领域,其研究目的在于获取生物分子氧化还原电子转移反应的机理,以及生物分子电催化反应机理,为正确了解生物活性分子的生物功能提供基础数据。所研究的生物分子包括小分子如氨基酸、生物碱、辅酶、糖类等和生物大分子如氧化还原蛋白、RNA、DNA、多糖等。
3. 电化学生物传感器
传感器与通信系统和计算机共同构成现代信息处理系统。传感器相当于人的感官,是计算机与自然界及社会的接口,是为计算机提供信息的工具。
传感器通常由敏感(识别)元件、转换元件、电子线路及相应结构附件组成。生物传感器是指用固定化的生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为感元件的传感器。电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件,电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号的传感器。图1是电化学生物传感器基本构成示意图。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件,所以电化学生物传感器具有高度选择性,是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。
根据作为敏感元件所用生物材料的不同,电化学生物传感器分为酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等。
(1) 酶电极传感器
以葡萄糖氧化酶(GOD)电极为例简述其工作原理。在GOD的催化下,葡萄糖(C6H12O6)被氧氧化生成葡萄糖酸(C6H12O7)和过氧化氢:
根据上述反应,显然可通过氧电极(测氧的消耗)、过氧化氢电极(测H2O2的产生)和pH电极(测酸度变化)来间接测定葡萄糖的含量。因此只要将GOD固定在上述电极表面即可构成测葡萄糖的GOD传感器。这便是所谓的第一代酶电极传感器。这种传感器由于是间接测定法,故干扰因素较多。第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子。第二代酶电极传感器可不受测定体系的限制,测量浓度线性范围较宽,干扰少。现在不少研究者又在努力发展第三代酶电极传感器,即酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子的酶电极传感器。 目前已有的商品酶电极传感器包括:GOD电极传感器、L 乳酸单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器等。在研究中的酶电极传感器则非常多。
(2) 微生物电极传感器
由于离析酶的价格昂贵且稳定性较差,限制了其在电化学生物传感器中的应用,从而使研究者想到直接利用活的微生物来作为分子识别元件的敏感材料。这种将微生物(常用的主要是细菌和酵母菌)作为敏感材料固定在电极表面构成的电化学生物传感器称为微生物电极传感器。其工作原理大致可分为三种类型:其一,利用微生物体内含有的酶(单一酶或复合酶)系来识别分子,这种类型与酶电极类似;其二,利用微生物对有机物的同化作用,通过检测其呼吸活性(摄氧量)的提高,即通过氧电极测量体系中氧的减少间接测定有机物的浓度;其三,通过测定电极敏感的代谢产物间接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物。
微生物电极传感器在发酵工业、食品检验、医疗卫生等领域都有应用。例如:在食品发酵过程中测定葡萄糖的佛鲁奥森假单胞菌电极;测定甲烷的鞭毛甲基单胞菌电极;测定抗生素头孢菌素的Citrobacterfreudii菌电极等等。微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有很好的应用前景,然而它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。
(3) 电化学免疫传感器
抗体对相应抗原具有唯一性识别和结合功能。电化学免疫传感器就是利用这种识别和结合功能将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置。
根据电化学免疫传感器的结构可将其分为直接型和间接型两类。直接型的特点是在抗体与其相应抗原识别结合的同时将其免疫反应的信息直接转变成电信号。这类传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。前者是将抗体或抗原直接固定在电极表面上,传感器与相应的抗体或抗原发生结合的同时产生电势改变;后者是用抗体或抗原制作抗体膜或抗原膜,当其与相应的配基反应时,膜电势发生变化,测定膜电势的电极与膜是分开的。间接型的特点是将抗原和抗体结合的信息转变成另一种中间信息,然后再把这个中间信息转变成电信号。这类传感器在结构上也可进一步分为两种类型:结合型和分离型。前者是将抗体或抗原固定在电极上;而后者抗体或抗原和电极是完全分开的。间接型电化学免疫传感器通常是采用酶或其他电活性化合物进行标记,将被测抗体或抗原的浓度信息加以化学放大,从而达到极高的灵敏度。
电化学免疫传感器的例子有:诊断早期妊娠的hCG免疫传感器;诊断原发性肝癌的甲胎蛋白(AFP或αFP)免疫传感器;测定人血清蛋白(HSA)免疫传感器;还有IgG免疫传感器、胰岛素免疫传感器等等。
(4) 组织电极与细胞器电极传感器
直接采用动植物组织薄片作为敏感元件的电化学传感器称组织电极传感器,其原理是利用动植物组织中的酶,优点是酶活性及其稳定性均比离析酶高,材料易于获取,制备简单,使用寿命长等。但在选择性、灵敏度、响应时间等方面还存在不足。
动物组织电极主要有:肾组织电极、肝组织电极、肠组织电极、肌肉组织电极、胸腺组织电极等。测定对象主要有:谷氨酰胺、葡萄糖胺 6 磷酸盐、D 氨基酸、H2O2、地高辛、胰岛素、腺苷、AMP等。 植物组织电极敏感元件的选材范围很广,包括不同植物的根、茎、叶、花、果等。植物组织电极制备比动物组织电极更简单,成本更低并易于保存。
细胞器电极传感器是利用动植物细胞器作为敏感元件的传感器。细胞器是指存在于细胞内的被膜包围起来的微小“器官”,如线粒体、微粒体、溶酶体、过氧化氢体、叶绿体、氢化酶颗粒、磁粒体等等。其原理是利用细胞器内所含的酶(往往是多酶体系)。
(5) 电化学DNA传感器
电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种全新思想的生物传感器。其用途是检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质。电化学DNA传感器是利用单链DNA(ssDNA)或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面,加上识别杂交信息的电活性指示剂(称为杂交指示剂)共同构成的检测特定基因的装置。其工作原理是利用固定在电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的同源序列的特异识别作用(分子杂交)形成双链DNA(dsDNA)(电极表面性质改变),同时借助一能识别ssDNA和dsDNA的杂交指示剂的电流响应信号的改变来达到检测基因的目的。
已有检测灵敏度高达10-13g/mL的电化学DNA传感器的报道,Hashimoto等[8]采用一个20聚体的核苷酸探针修饰在金电极上检测了PVM623的PatⅠ片断上的致癌基因v myc。电化学DNA传感器离实用化还有相当距离,主要是传感器的稳定性、重现性、灵敏度等都还有待于提高。有关DNA修饰电极的研究除对于基因检测有重要意义外,还可将DNA修饰电极用于其它生物传感器的研究,用于DNA与外源分子间的相互作用研究[9],如抗癌药物筛选、抗癌药物作用机理研究;以及用于检测DNA结合分子。无疑,它将成为生物电化学的一个非常有生命力的前沿领域。
生物电化学所涉及的面非常广,内容很丰富。以上介绍的只是该交叉学科一些领域的概况。可以相信,随着相关学科的发展,生物电化学将进一步蓬勃发展
南海北部陆坡神狐海域HS-岩心表层沉积物古菌多样性
张勇1，苏新1，陈芳2，蒋宏忱并稿1，陆红峰2，周洋2，王媛媛1
张勇（1981－），男，博士研究生，主要从事海洋地质微生物研究。
1.中国地质大学地质微生物实验室，北京 100083
2.广州海洋地质调查局，广州 510760
摘要：利用分子生物学技术，分析南海北部神狐海域天然气水合物潜力区HS-373PC岩心表和姿层沉积物中古菌多样性，从沉积物中提取总DNA并扩增古菌16S rRNA基因序列，对克隆文库进行系统发唤蔽绝育分析。结果显示：所有古菌序列均属于泉古菌（Crenarchaeota）和广古菌（Euryarchaeota）。其中泉古菌以C3为主要类群，另有少量序列属于marine benthic group (MBG)-B,MBG-C、marine crenarchaeotic group I (MGI）、marine hydrothermal vent group (MHVG）和novel group of crenarchaea(NGC）；广古菌以MBG-D为主，其他序列分别属于Unclassified Euryarchaeotic Clusters-1/2 (UEC-1/2）。
关键词：古菌多样性；16S rRNA；海洋沉积物；天然气水合物调查区；神狐海域；南海北部陆坡
Archaea Diversity in Surface Marine Sediments from Shenhu Area,Northern South China Sea
Zhang Yong1,Su Xin1,Chen Fang2,Jiang Hongchen1,Lu Hongfeng2,Zhou Yang2,Wang Yuanyuan1
1.Geomicrobiology Laboratory,School of Ocean Sciences,China University of Geosciences,Beijing 100083,China
2.Guangzhou Marine Geological Survey,Guangzhou 510760,China
Abstract:Archaeal diversity in the surface sediments from Shenhu Area in South China Sea was studied with the use of 16S rRNA gene phylogenetic analysis.All the retrieved archaeal clone sequences could be grouped into Marine Benthic Group(MBG)-B,-C and-D,Novel Group of Crenarchaea,C3,Marine Hydrothermal Vent Group,Marine Crenarchaeotic Group I,and unclassified euryarhaeotic group,among which MBG-D and C3 were the most predominant groups in the Euryarchaeota and Crenarchaeota,respectively.The results indicated that archaea were abundant and diverse in surface sediments from the northern South China Sea.
Key words:archaeal diversity; 16S rRNA; marine sediments; gas hydrate exploration area; shenhu area;northern south China Sea
0 引言
海洋生态环境独特，具有高盐、高压、低温、寡营养和光照强度变化大等特点。生活在这一复杂环境中的微生物为适应独特环境条件，在物种类型、代谢类型、功能基因组成和生态功能上形成丰富的多样性[1]，其中原核微生物主要为古菌和细菌两大类群[2]。早期有关古菌存在及多样性的研究仅局限于温度、p H和盐度比较极端与厌氧的环境下，在这些极端环境中发现了超嗜热菌、极端嗜酸菌、极端嗜盐菌和产甲烷菌。目前已经从热泉、热液喷孔、硫质喷孔、盐湖、高碱湖、下水道消化池和瘤胃这些典型的环境中分离出了古菌[2]。随着分子生物学技术的发展，古菌研究的范围逐渐扩大，常见的环境比如海水[3]、盐湖水[4]和土壤[5-6]中，都发现有大量的古菌存在。随着研究领域的扩大，对古菌的分布、新陈代谢的多样性、从极端环境到普通环境的垂向变化以及在生态系统中所起作用的研究显得愈加重要。海洋深部生物圈内的古菌群落已经作为特定地质微生物标志，被用来指示过去和现代海洋的地球化学变化和地质环境的变迁[7]。
南海神狐海域天然气水合物调查研究区位于南海北部陆坡中段神狐暗沙东南海域附近，即西沙海槽与东沙群岛之间海域。根据野外地温梯度测量和室内沉积物样品的热导率测量结果以及钻探站位温度原位测量结果表明，神狐海域研究区的地温梯度为45～67.7℃/km，其热流和地温梯度处于中—低范围，该区域流体相对活跃，断层发育，有利于天然气水合物的发育[8]。2006年我国在该区实施钻探，已经成功获取了天然气水合物样品[8]。笔者对神狐海域天然气水合物调查区HS-373PC样品岩心表层5～20 cm深度沉积物开展了古菌多样性的调查，并初步探讨它们与沉积物中地质环境的相互作用。
1 材料方法
1.1 样品采集
2006年夏， “ 海洋四号”调查船在南海北部神狐海域（19°51.2803 ' N,115°12.0888 ' E）水深1 402 m处获得重力活塞岩心HS-373PC样品，岩心全长928 cm。本文通信作者随船考察，并采取微生物样。微生物取样间隔为50 cm，取样后在无菌箱中切除表面沉积物，内部样品置于无菌袋保存于液氮中，航次结束后用干冰运至实验室于－20℃保存。实验室操作时，切除表面沉积物以防止污染。
用于微生物计数的样品采集参考国际大洋钻探（ODP:ocean drilling program)201和204航次中所应用的微生物样品处理方法[9-10]，在无菌操作箱中进行：用灭菌手术刀切除岩心外部沉积物，灭菌注射器取约1 cm3样品，加入9 m L高温灭菌并过滤除菌（0.2 mm）的海水，加入终浓度为4％的甲醛固定，置于4℃保存。航次结束后低温运到实验室4℃保存。
1.2 微生物计数（acridine orange direct count,AODC）
样品细胞计数参照吖啶橙直接染色计数法[11]改进。样品漩涡震荡10 min，取1 m L加入9 m LPBS(0.145 mol/L Na Cl,0.0045 mol/L KH2PO4,0.0055 mol/L K2HPO4，灭菌）缓冲液，震荡5min,400r/min离心5 min，静置1 h充分沉淀，取上清液加入1％的吖啶橙5m L，黑暗中染色15 mm，过滤到孔径0.22μm的聚碳酸酯膜（Whatman,UK）上，用10 m L PBS缓冲液冲洗滤膜，置于载玻片上，于荧光镜下观察计数。
1.3 DNA提取与16Sr DNA的扩增
称取约1 g样品，使用Ultra Clean soil DNAkit (Mo Bio,Solana Beach,Calif.,US）试剂盒提取总DNA，溶于灭菌的纯水中。
古菌扩增引物为：Arch21F(5’－TTC YGG TTGATC CYG CCRGA-3’，Y=A,C or G;R=A or G）和Arch958R(5’－YCC GGC GTT GAM TCCATTT-3’，M=Aor C)[3]。PCR反应条件：95℃变性7min，然后94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸1.5min,45个循环，最后72℃延伸10 min。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。
1.4 克隆文库的构建与5序列分析
纯化回收后的PCR产物连接到p GEM-T Easy Vector(Promega,US）上，转化Escherichiacoli.JM109感受态细胞。取适量转化后培养的细胞涂到含氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB平板上， 37℃培养过夜，12～16 h后取出，置于4℃冰箱。
随机挑选部分白色转化子，接种到上述LB平板上，37℃培养后，使用引物M13-RV (5'－CAG GAA ACA GCT ATG AC-3＇）和M13-47(5'－GTT TTC CCA GTC ACG AC-3＇）做菌落PCR。反应条件如下：95℃变性10min，加入1.25U Taq酶，然后94℃变性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸2min,35个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选部分样品进行测序。
所得序列用Sequencer 4.8(Gene Codes Corporation,US）软件进行分析，经Bio Edit软件编辑后，以97％的序列相似性作为划分标准[12]，使用DOTUR软件（）选出运算分类单位（operational taxonomic unit，或OTU），用a Rarefact Win软件（～strata/software.html.）得出饱和曲线。所得OTU对应序列输入NCBI数据库，在线使用BLAST (basic local alignment search tool）对比序列，采用Neighbor-Joining建树方法构建系统发育树。
本研究中所得到的古菌16Sr DNA序列在Gen Bank核酸数据库里的接受序列号为HS373A1－HS373A98(FJ896063-FJ896103); HS373A107-HS373A16(GU181294-GU181316）。
2 结果与分析
2.1 沉积物微生物计数
表层沉积物中的总微生物计数使用吖啶橙染色直接计数法，计数结果显示微生物的数量约为1.69×107cells/g沉积物（湿重）。
2.2 古菌多样性分析
所测序列经筛选后得到132个有效序列，共分为64个OTU。文库覆盖率C=1－(n/N） （其中n为OTU中只出现一个克隆子的数目，N为总序列数）为68.2％。使用a Rarefact Win软件分析得到克隆文库的饱和曲线（图1）。
图1 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物中古菌16SrRNA基因序列饱和曲线
该132个序列均属于未培养类型，同源序列大多数来自海洋沉积物，分别属于泉古菌（Crenarchaeota）和广古菌（Euryarchaeota）两大类（图2）。其中泉古菌以C3[13]为主（占总序列的24％），其他序列属于marine benthic group (MBG)-B[14],MBG-C[15],marine crenarchaeotic group Ⅰ（MGI)[16],marine hydrothermal vent group (MHVG)[17]和novel group ofcrenarchaea(NGC)[15]。广古菌以MBG-D[13]为主（占总序列的16％），其他序列属于unclassified euryarchaeotic clusters (UEC)-1/2。各类群所占比例见图3。
泉古菌中包含92个克隆序列（占总序列的70%）。其中以C3为主要类群，包含32个克隆，同源序列来源广泛，其中大多数来自南海沉积物中，相似性在97％～99％之间。其他同源性最高的序列来自太平洋秘鲁边缘海（ODP Leg 201）和喀斯喀特边缘海（ODP Leg 204）含有水合物的沉积物[13]、墨西哥湾沉积物（AB448792）和维多利亚港沉积物（EF203609）。MBG-B（也称为Deep-Sea Archaeal Group,DSAG)[17-19]类群最先发现于深海沉积物和热液口，该类群广泛存在于多种深海环境中[20]，文库中有2个克隆属于该类群，同源序列来自鄂霍次克海冷泉沉积物[15]、墨西哥湾沉积物（IODP Site 1230）和Juan de Fuca海岭沉积物[15]，相似性为98％～99％，这几个地区沉积物均发现水合物存在。20个克隆属于MBG-C，同源序列（相似性为95％～99％）来自深海沉积物和红树林土壤。12个克隆属于MGI，同源序列源自南海沉积物[16,21]和北冰洋沉积物（FJ571813），相似性在97％～99％之间。有4个克隆属于MHVG，与来自墨西哥湾沉积物的克隆（AB432999）相似性最高（99%）。NGC类群有20个克隆，其中相似性最高（相似性98％）的序列（EU713901）来自鄂霍次克海[15]，其他克隆相似性最高的序列（DQ984855）和（AB433026）分别来自南海沉积物和墨西哥湾深海沉积物，相似性仅为89％和92％。
广古菌包含40个（占总序列的30％）克隆序列。其中MBG-D是优势类群，有21个克隆属于该类群，分为13个OTU。其中大部分克隆同源序列来源于南海[16,21]、智利瓦斯科湖、Skan湾[22]、墨西哥湾、日本南海海槽[23]、鄂霍次克海[15]和秘鲁边缘（ODP Leg 201）有机含量丰富不含水合物的深海沉积物[13]。另2个克隆相似性最高的序列（AF068817）来自大西洋中脊热压喷口[24]，同源性只有86％。19个克隆组成UEC类群，9个克隆属于UEC-1，同源序列来源于南海沉积物、Baby Bare海湾热液喷口[25]和Skan湾[22]。10个克隆属于UEC-2，相似性最高的序列来源于南海[26]和Santa Barbara海盆[27]，相似性在96％～99％之间。
3 讨论
海底沉积物表层有机质含量相对比较丰富，为微生物的生长繁殖提供充足的物质能量。据统计太平洋表层沉积物中微生物（包括细菌和古菌）丰度为108～109cells/cm3沉积物[28]，有活性的微生物丰度为108cells/cm3沉积物[29]。本文HS-373PC岩心表层沉积物使用吖啶橙染色计数获得的微生物的数量，与南海南沙盆底陆坡沉积物中使用荧光原位杂交计数的结果[16]相比数量偏低。
图2 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物中古菌16SrRNA基因序列系统发育树
图3 南海北部HS-373PC岩心表层沉积物古菌文库中各类群所占的比例
（其中“Un”为未分类的类别）
HS-373PC岩心的表层沉积物中古菌多样性虽然比较高，但从序列类别来说，大部分所在的类群在其他海区沉积物中都有发现[13,15,17-20,22-24]。尤其是大多数序列与南海其他地区沉积物中所报道的古菌类群[16,21,26]具有很高的相似性。而且在群落组成结构等方面比较起来还是有所不同。
与南海其他地区古菌类群相比，如在西沙海槽表层沉积物中古菌以MGI为主要类群（49.2%），其他包括TMEG(terrestrial miscel1aneous euryarch-aeotic group）、MBG-A/B/D、C3和NEG(novel euryarchaeotic group）类群以及17％的UEC克隆[21]。南海琼东南沉积物中古菌以MCG和MBG-B(DSAG）为主要类群（各占27％），其他还存在MBG-D、SAGMEG、TMEG和3个克隆的甲烷八叠球菌（Methanosarcinales）以及29％的UEC克隆[26]。MGI类群常发现于海洋和陆地环境，在海洋环境中，广泛分布于表层和次表层沉积物中，该类群可能兼性自养或者代谢类型多样[30]。本文神狐海域水合物潜力区的表层沉积物中的古菌，也有MGI类群出现，该类群所占比例仅为9％。MBG-B类群最先发现于热液口深海沉积物，目前在深海海底沉积物中均发现此类群[20]，该类群在底部甲烷上涌流的上层硫酸盐还原带沉积物中含量丰富，可能在硫酸盐还原和甲烷氧化中起重要作用[31]；此类群在南海琼东南盆地表层沉积物中所占比例较高，在神狐海域表层沉积物中，只有2个克隆出现，测试表明该深度甲烷体积分数较低（约40×10-6），而硫酸根质量浓度较高（2 655 mg/L），说明该深度甲烷氧化与硫酸盐还原程度还比较低。
与上述南海所报道2个地区古菌多样性相比，神狐海域HS-373PC表层沉积物中古菌C3类群的克隆明显占优。该类群尚未有培养种类，具体代谢类型还不清楚。类群中相似性最高的序列来自太平洋秘鲁边缘（ODP Leg 201）和喀斯喀特边缘海（ODP Leg 204）含有水合物的沉积物。
西太平洋日本南海海槽含有天然气水合物的沉积物中，古菌多样性很低，只发现有3种类群的古菌类群，分别与脱硫球菌、热网菌和热球菌相似，没有发现其他类群[32]。东太平洋美国俄勒冈州外海水合物海岭的ODP 204航次1244、1245和1251站位有水合物存在的表层沉积物岩心中，古菌以MBG-B(DSAG）类群为主[13]（约占50％～100%）。而位于东太平洋赤道海域ODP 201航次几个地质环境不同钻探站位的表层沉积物中古菌群落结构不同，其中1230站位（含天然气水合物）古菌以MBG-B(DSAG）类群为主[13];1227站位（不含水合物但有机质含量丰富）古菌以MCG和SAGMEG为主要类群，不含MBG-B(DSAG）类群[13]；而1225站位（不含天然气水合物且有机含量低）古菌以MGI和MBG-A为主要类群，但含少量MBG-B(DSAG）类群[13]。由此可见，即使是在发现了天然气水合物的地区，表层样中古菌的类型和群落结构也随海域或同海域不同站位地质环境而变化。神狐海域HS-373PC表层沉积物古菌的优势类群和上述地区明显不同。前人对南海表层沉积物有机质含量的总结表明，神狐地区属于有机质含量较低的地区[33]。因此，如果就HS-373PC表层沉积物中有机质含量低而古菌群落含少量MBG-B类群这2点来看，和东太平洋赤道海域ODP 201航次1225站位具有一定的相似性。
该岩心采集的区域属于已确定的天然气水合物潜力区，一系列的数据强烈暗示该区沉积物深部存在着天然气水合物[8]。但对该岩心表层沉积物中古菌多样性分析后发现，古菌中没有明显指示天然气水合物存在的类群出现，可能是本文所取的样品处于沉积物表层，各种参数变化不明显，在古菌多样性上没有明显的显示。对于HS-373PC岩心中微生物多样性和地质环境的关系进一步的探讨，还有待于建立在未来获得更多微生物和地质环境分析的基础上。
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处理离体小瓜虫对照组用什么
多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态
2019-12-08农业科技
摘要：【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)感染过程中的免疫作用，为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后，采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后，TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势，TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达，在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同，其中，MyD88基因的表达在感染后第1～3 d均呈显著上调趋势(P0.05，下同)，而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P0.05);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势，但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调，但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应，尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。
关键词： 草鱼;多子小瓜虫;Toll样受体(TLR);信号通路;基因表达

引言
【研究意义】Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)属于I型跨膜蛋白，是一类重要的模式识别受体，能特异性识别病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，并通过敏闹弯募集接头蛋白、转导信号及诱导炎性弯乱细胞因子等表达而发挥免疫防御作用，既是机体的第一道天然屏障，也是连接先天性免疫和获得性免疫的重要桥梁(何玉洁和潘建平，2017)。因此，研究TLR信号通路基因在病原感染桥闷过程中的表达动态，对揭示病原和鱼类间的免疫互作机制及制定有效的防控措施具有重要意义。【前人研究进展】依据接头蛋白的不同哺乳动物TLR信号通路可分为髓系分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)依赖型和β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TIR domain-containing adaptor-inducing IFN-β，TRIF)依赖型(Yuk and Jo，2011)。TLRs在识别相应的PAMPs后，除TLR3外，其他TLRs均以MyD88为接头蛋白，然后招募白细胞介素-1受体相关激酶4(IL-1 receptor-associated kinase 4，IRAK4)和IRAK1，再将信号转导给肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)，TRAF6与转化生长因子β活化激酶1(Transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)及其结合蛋白(TAK1-binding proteins，TABs)TAB1和TAB2组合成复合物，从而激活下游的NF-κB和AP-1等转录因子，诱导免疫因子表达，最终启动免疫防御反应(Jiménez-Dalmaroni et al.，2016)。其中，TLR2和TLR4识别细菌的脂肽和脂多糖等;TLR3识别病毒的双链RNA;TLR5识别细菌的鞭毛蛋白;TLR7和TLR8识别病毒的单链RNA;TLR9识别非甲基化的CpG-DNA(Tan and Kagan，2017)。目前，有关TLRs与寄生虫感染的相关性研究仍较少，仅发现TLR2或TLR4可识别利什曼原虫(Leishmania major)(Bec-ker et al.，2003)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)(Debierre-Grockiego et al.，2007)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(Zhu et al.，2011)的糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定蛋白;TLR9可识别克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)非甲基化的DNA(Bafica et al.，2006);TLR11能识别刚地弓形虫的Profilin-like蛋白(Yaro-vinsky et al.，2005)等。至今，已在哺乳动物中发现15种TLRs，而从鱼类中至少鉴定出20种TLRs(范泽军等，2015)。针对鱼类的研究主要集中在TLRs与细菌或病毒感染的相关性方面(Liao et al.，2017)。Li等(2011a，2011b，2012，2016)研究发现，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)的TLR2、TLR9、TLR21、MyD88及IRAK1等广泛参与抵御刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)感染的免疫反应，表明鱼类TLR信号通路基因在防御寄生虫的感染过程中发挥重要作用。【本研究切入点】多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)是一种广泛分布的纤毛类寄生性原虫，几乎可感染全部淡水鱼类，引起小瓜虫病(俗称白点病)，导致鱼类死亡或引起细菌、病毒等继发性感染，而造成巨大的经济损失(宋飞彪等，2012;赵飞等，2012)。草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国最重要的水产养殖鱼类之一，约占淡水鱼总产量的20%，但草鱼养殖一直深受小瓜虫病困扰。早期研究发现，草鱼的TRAF6、TAK1、TAB1和TAB2及斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的TLR1、TLR2、TLR9和TLR21等TLR信号通路基因参与了抵御多子小瓜虫感染的免疫应答(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)，但草鱼TLR信号通路其他基因是否参与并发挥防御多子小瓜虫感染作用等机理尚不清楚。【拟解决的关键问题】以多子小瓜虫感染草鱼后通过实时荧光定量PCR检测分析草鱼的部分TLRs(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化，明确草鱼TLR信号通路基因在防御多子小瓜虫感染过程中的免疫作用，为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
草鱼购自广东省佛山市某养殖场，健康活泼，规格整齐，体重约50 g/尾，在养殖过程中未感染过多子小瓜虫。随机挑取10尾草鱼，镜检鱼鳃和体表均未发现多子小瓜虫或其他寄生虫。草鱼在实验室内的循环流水养殖箱中暂养2周，氧气充足，水温控制在(23±1)℃，每日定时投喂商品饲料2次。多子小瓜虫从患病草鱼上分离获得，采用农业农村部渔用药物创制重点实验室建立的以斑点叉尾鮰为宿主的室内传代系统进行保种传代(Zhao et al.，2013a，2013b，2014)。
1. 2 多子小瓜虫幼虫准备
在多子小瓜虫传代过程中将体表已显现白点的斑点叉尾鮰置于5 L的塑料烧杯中，发育成熟的包囊将从鱼体上自动脱落，分别用孔径250和75 μm的网筛过滤、收集包囊。将包囊轻轻洗净后转入1 L的玻璃烧杯中，添加少量无菌水，23 ℃孵化20 h即发育成幼虫，再以孔径40 μm的网筛过滤，得到活体幼虫滤液。取10份10 μL的幼虫滤液，显微镜下观察计数，换算出总滤液中的多子小瓜虫活体幼虫数量，用于后续的草鱼感染试验。
1. 3 感染试验
将120尾草鱼随机平均分成感染组和对照组。感染组的60尾草鱼置于60 L的水桶中，按1∶10000的感染剂量加入多子小瓜虫活体幼虫进行体表感染，感染2 h后将草鱼转至250 L的鱼缸中。采用相同方法处理对照组的60尾草鱼，但不添加多子小瓜虫幼虫。于感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d时分别从感染组和对照组随机取样6尾草鱼。以灭菌刀片刮去草鱼背部中央的鳞片，使用尖头镊子剥离1.0 cm×1.5 cm大小的皮肤，轻轻刮除皮肤内侧肌肉以得到干净的背部皮肤，液氮速冻后-70 ℃保存备用。同时快速采集脾脏冻存备用。
1. 4 总RNA提取及cDNA合成
采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司)提取草鱼皮肤和脾脏组织的总RNA，以Nanodrop 1000微量紫外分光光度计(Thermo公司)和1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。使用RNase-free DNase I(Fermentas公司)去除基因组DNA后，按ReverTra Ace@ Reverse Transcriptase试剂盒(TOYOBO公司)说明反转录合成cDNA，反应程序：42 ℃ 20 min;99 ℃ 5 min;4 ℃ 5 min。合成的cDNA置于-20 ℃冰箱保存备用。
1. 5 目的基因片段克隆及测序分析
采用Beacon Designer 8.0设计草鱼TLR信号通路基因的特异性引物(表1)。以草鱼脾脏cDNA为模板进行目的基因PCR扩增，反应体系25.00 μL：cDNA模板1.00 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.00 μL，10×PCR Buffer(Mg2+)2.50 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.00 μL，rTaq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用E.Z.N.A? Gel Extraction Kit(OMEGA公司)进行目的条带回收纯化，然后TA克隆至pMD18-T载体上，再转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。取100.00 μL菌液凃布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB培养基上，37 ℃培养过夜，挑选3个菌落PCR验证呈阳性的克隆送至广州艾基生物技术有限公司测序。
1. 6 实时荧光定量PCR检测分析
采用实时荧光定量PCR检测感染多子小瓜虫后草鱼皮肤和脾脏组织中TLR信号通路基因的表达动态，以每个时间点各组织的cDNA为模板、β-action为内参基因，在Roche LightCycler480 Real-time PCR Detection System上进行定量检测分析。反应体系10.00 μL：cDNA模板0.40 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.40 μL，SYBR Green Real-time PCR Master Mix 5.00 μL，ddH2O 3.80 μL。每个样品均设3个重复。扩增程序：95 ℃预变性30 s;95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环，每个循环结束时采集1次荧光信号。采用2-△△Ct法(Livak and Schmittgen，2001)计算目的基因的相对表达量，并以SPSS 22.0进行统计分析。
2 结果与分析
2. 1 感染多子小瓜虫后草鱼TLRs基因表达的动态变化
2. 1. 1 TLR1和TLR2基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，其皮肤和脾脏的TLR1和TLR2基因表达主要呈上调趋势(表2)。在感染后第12 h，TLR1基因在皮肤中开始显著上调表达(P0.05，下同)，是对照组的3.02倍，至感染后第1和2 d持续上调至对照组的5.38和6.31倍;在脾脏中，TLR1基因在感染后第2和3 d时分别上调2.49和4.69倍，在其他时间点与对照组间无显著差异(P0.05，下同)。TLR2与TLR1基因的表达变化相似，在皮肤中表现为感染后第1～3 d均显著上调，于感染后第3 d达峰值，为对照组的4.35倍;在脾脏中表现为感染后第2和3 d显著高于对照组，分别是对照组的2.89和5.69倍。
2. 1. 2 TLR4基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，TLR4基因在其皮肤和脾脏中的表达变化趋势不同(表2)。在皮肤中，TLR4基因在感染后第12 h上调为对照组的2.82倍，但至感染后第1 d回落到对照组水平，随后其表达又逐渐上调，于感染第3 d达峰值(4.55倍)。而在脾脏中，TLR4基因在感染后第12 h和第1 d的表达量显著下调，仅为对照组的35%和25%;在其他时间点与对照组间均无显著差异。
2. 1. 3 TLR9基因的表达动态 草鱼感染多子小瓜虫后，其皮肤中的TLR9基因在感染后第2、3和7 d均呈显著上调表达，于感染后第3 d达峰值(3.35倍);而在脾脏中，TLR9基因除在感染第1 d显著上调2.45倍和感染后第3 d显著下调39%外，其他时间点与对照组间均无显著差异(表2)。
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世界精细化工总体发展现状及趋势精细化工是当渣胡巧今化学工业中最具活力的新兴领域之一，是新材料的重要组成部分。精细化工产品种类多、附加值高、用途广、产业关联度大，直接服务于国民经济的诸多行业和高新技术产业的各个领域。大力发展精细化工已成为世界各国调整化学工业结构、提升化学工业产业能级和扩大经济效益的战略重点。精细化工率(精细化工产值占化工总产值的比例)的高低已经成为衡量一个国家或地区化学工业发达程度和化工科技水平高低的重要标志。一、世界精细化工总体发展态势综观近20多年来世界化工发展历程，各国、尤其是美国、欧洲、日本等化学工业发达国家及其著名的跨国化工公司，都十分重视发展精细化工，把精细化工作为调整化工产业结构、提高产品附加值、增强国际竞争力的有效举措，世界精细化工呈现快速发展态势，产业集中度进一步提高。进入21世纪，世界精细化工发展的显著特征是：产业集群化，工艺清洁化、节能化，产品多样化、专用化、高性能化。1、精细化学品销售收入快速增长，精细化率不断提高上世纪九十年代以来，基于世界高度发达的石油化工向深加工发展和高新技术的蓬勃兴起，世界精细化工得到前所未有的快速发展，其增长速度明显高于整个化学工业的发展。近几年，全世界化工产品年总销售额约为1.5万亿美元，其中精细化学品和专用化学品约为3800亿美元，年均增长率在5～6%，高于化学工业2～3个百分点。预计至2010年，全球精细化学品市场仍将以6%的年均速度增长。2008年，世界精细化学品市场规模将达到4500亿美元。目前，世界精细化学品品种已超过10万种。精细化率是衡量一个国家和地区化学工业技术水平的重要标志。美国、西欧和日本等化学工业发达国家，其精细化工也最为发达，代表了当今世界精细化工的发展水平。目前，这些国家的精细化率已达到60～70%。近几年，美国精细化学品年销售额约为1250亿美元，居世界首位，欧洲约为1000亿美元，日本约为600亿美元，名列第三。三者合计约占世界总销售额的75%以上。2、加强技术创新，调整和优化精细化工产品结构加强技术创新，调整和优化精细化工产品结构，重点开发高性能化、专用化、绿色化产品，已成为当前世界精细化工发展的重要特征，也是今后世界精细化工发展的重点方向。以精细化工发达的日本为例，技术创新对精细化学品的发展起到至关重要的作用。过去10年中，日本合成染料和传统精细化学品市场缩减了一半，取而代之的是大量开发功能性、绿色化等高端精细化学品，从而大大提升了精细化工的产业能级和经济效益。例如，重点开发用于半导体和平板显示器等电子领域的功能性精细化学品，使日本在信息记录和显示材料等高端产品领域建立了主导地位。在催化剂方面，随着环保法规日趋严格，为适应无硫汽油等环境友好燃料的需要，日本积极开发新型环保型催化剂。目前超深脱硫催化剂等高性能催化剂在日本催化剂工业中已占有相当高的份额，脱硫能力从低于50μg/g提高至低于10μg/g，由此也促进了催化剂工业的整体发展。2004年日本用于深度脱硫等加氢工艺的炼油催化剂产量比上年同期增长了近60%，销售额增长了43%。与此同时，用于石油化学品和汽车尾气净化的催化剂销售额也以两位数的速度增长，已占催化剂市场半壁江山。日本催化剂生产和销售去年分别增长了7%和5%，打破了近六年来的记录。3、联合兼并重组，增强核心竞争力许多知名的公司通过兼并、收购或重组，调整经营结构，退出没有竞争力的行业，发做胡挥自己的专长和优势，加大对有竞争力行业的投入,重点发展具有优势的精细化学品，以巩固和扩大市场份额，提高经济效益和国际竞争力。例如，2005年7月，世界著名橡胶助剂生产商——美国康普顿公司(Crompton)花20亿美元收购了大湖化学公司后成立名为“科聚亚”公如键司(Chemturags)，成为继鲁姆哈斯和安格公司后的美国第三大精细化工公司和全球最大的塑料添加剂生产商。新公司的产品包括了塑料添加剂、石化添加剂、阻燃剂、有机金属、聚氨酯、泳池及温泉维护产品及农业化学品，在高价值产品的市场上具有领导地位，其精细化工的年销售额可达到37亿美元。又如，德固赛和美国塞拉尼斯各出资50%合并羰基合成产品，在欧洲建立丙烯—羰基合成产品生产基地。合并后，羰基合成醇年产量将达到80万吨——占欧洲市场份额的三分之一。与此同时，德固萨公司以6.7亿美元价格将其食品添加剂业务出售给嘉吉公司(Cargill)。从而使嘉吉公司成为食品添加剂行业的领先者，能向全球的食品及饮料公司提供各种专用添加剂。再如，总部位于荷兰海尔伦的皇家帝斯曼公司(DSM)，2003年2月以19.5亿欧元的代价，收购了罗氏全球的维生素、胡萝卜素和精细化工业务，成为世界维生素之王。2004年全球销售额80亿欧元(约为100亿美元)。二、我国精细化工发展现状与趋势近十多年来，我国十分重视精细化工的发展，把精细化工、特别是新领域精细化工作为化学工业发展的战略重点之一和新材料的重要组成部分，列入多项国家计划中，从政策和资金上予以重点支持。目前，精细化工业已成为我国化学工业中一个重要的独立分支和新的经济效益增长点。我国近期出台的《“十一五”化学工业科技发展纲要》又将精细化工列为“十一五”期间优先发展的六大领域之一，并将功能涂料及水性涂料，染料新品种及其产业化技术，重要化工中间体绿色合成技术及新品种，电子化学品，高性能水处理化学品，造纸化学品，油田化学品，功能型食品添加剂，高性能环保型阻燃剂，表面活性剂，高性能橡塑助剂等列为“十一五”精细化工技术开发和产业化的重点。可以预见，随着我国石油化工的蓬勃发展和化学工业由粗放型向精细化方向发展，以及高新技术的广泛应用，我国精细化工自主创新能力和产业技术能级将得到显著提高，成为世界精细化学品生产和消费大国。1、精细化工取得长足进步，部分产品居世界领先地位我国精细化工的快速发展，不仅基本满足了国民经济发展的需要，而且部分精细化工产品，还具有一定的国际竞争能力，成为世界上重要的精细化工原料及中间体的加工地与出口地，精细化工产品已被广泛应用到国民经济的各个领域和人民日常生活中。统计表明，目前我国精细化工门类已达25个，品种达3万多种，已建成精细化工技术开发中心10个，精细化学品生产能力近1350万吨/年，年总产量近970万吨，年产值超过1000亿元。2004年，我国精细化工率已上升到45%。近年来，我国的染料产量已跃居世界首位，2004年，染料产量达到了59.83万吨，约占世界染料产量的60%。目前已能生产的品种超过1200个，其中常年生产的品种约700个。我国不仅是世界第一染料生产大国，而且是世界第一染料出口大国，染料出口量居世界第一，约占世界染料贸易量的25%，已成为世界染料生产、贸易的中心，在世界染料市场占有显著地位，2004年出口量达到22.66万吨。涂料产量2004年达到298万吨，比2000年净增104万吨，成为世界第二大涂料生产国。农药产量居世界第二位。柠檬酸的年出口量已接近40万吨，约占全球总消费量的三分之一；维生素C的出口量已突破5万吨，占全球总消费量的50%以上。2、建设精细化工园区，推进产业集聚近几年，许多省市都把建设精细化工园区，作为调整地方化工产业布局、提升产业、发展新材料产业、推进集聚的重要举措。据报道，目前全国已建和在建的精细化工园区至少有15个。例如，浙江上虞精细化工园区规划总面积20平方公里，自1999年1月正式启动以来，共引进来自10个国家、地区和10个省市的项目80多个，资金逾25亿元。到2004年9月已经有140余家精细化工企业入驻，其中年销售收入在500万以上的规模企业有53家，并形成了以染料(颜料)、生物医药及中间体和专用化学品为主要门类的精细化工产业。2003年上虞精细化工产业实现销售收入119.5亿元、利税22.6亿元，出口创汇1.75亿元。基地提出了6年后培育20家高新技术企业，实现技工贸收入300亿元的目标。该园区已被科技部认定为国家火炬计划上虞精细化工特色产业基地。又如，中国精细化工(常州)开发园区，已形成精细化工为特色，通达上下游多个领域的化工生产和仓储基地。到2003年9月，已累计投资近200亿元，有72家化工企业落户，其中有世界500强中的美国亚什兰化学公司、日本普利司通轮胎公司和韩国现代公司等知名企业。3、跨国公司加速来华投资，有力推动精细化工发展跨入21世纪以来，随着经济全球化趋势快速发展，以及我国民经济持续稳步快速发展对精细化学品和特种化学品强大市场需求，吸引了诸多世界著名跨国公司纷纷来我国投资精细化工行业，投资领域涉及精细化工原料和中间体、催化剂、油品添加剂、塑料和橡胶助剂、纺织/皮革化学品、电子化学品、涂料和胶粘剂、发泡剂和制冷剂替代品、食品和饲料添加剂以及医药等，从而有力地推动我国精细化工产业的发展。例如，世界著名的精细化学品生产商、德国第3大化学品公司德固赛公司看好中国专用化学品市场，1998年以来，德固萨公司已在我国南京、广州、上海、青岛、天津和北京等11个地区建有18家生产厂，2004年实现营业额达到3亿欧元。为了扩大中国市场，并成为中国特种化工领域的领跑者，德古萨去年在上海成立了研发中心，为中国乃至亚洲市场研发专用产品。又如，世界10大涂料公司已全部进入我国，迄今为止独资和合资建筑涂料厂约16家，生产规模都在2～5万吨/年。近两年来立邦公司投资41亿日元使廊坊公司和苏州公司的生产能力各扩建为16万吨，上海扩建为14万吨，广州为7万吨，全部项目2005年竣工投产，届时立邦将占中国19%的市场份额。以生产不含铅、汞等有毒有害成分涂料著称的ICI公司声称要在中国市场的争夺中超越立邦成为第一。ICI和立邦的产品销售额现占中国市场的30%。用于生命科学的电化学技术由于生命现象与电化学过程密切相关,因此电化学方法在生命科学中得到广泛应用,其内容非常丰富,主要有电脉冲基因直接导入、电场加速作物生长、癌症的电化学疗法、电化学控制药物释放、在体研究的电化学方法、生物分子的电化学行为等。本节简单地介绍一下这些用于生命科学的电化学技术。电脉冲基因直接导入是基于带负电的质粒DNA或基因片断在高压脉冲电场的作用下被加速“射”向受体细胞,同时在电场作用下细胞膜的渗透率增加(介电击穿效应),使基因能顺利导入受体细胞。由于细胞膜的电击穿的可逆性,除去电场,细胞膜及其所有的功能都能恢复。此法已在分子生物学中得到应用。细胞转化效率高,可达每微克DNA1010个转化体,是用化学方法制备的感受态细胞的转化率的10～20倍。电场加速作物生长是很新的研究课题。Matsuzaki等报道过玉米和大豆苗在含05mmol/LK2SO4培养液中培养,同时加上20Hz,3V或4V(峰峰)的电脉冲,6天后与对照组相比,秧苗根须发达,生长明显加速。据称其原因可能是电场激励了生长代谢的离子泵作用。癌症的电化学疗法是瑞典放射医学家Nordenstrom开创的治疗癌症的新方法。其原理是:在直流电场作用下,引起癌灶内一系列生化变化,使其组织代谢发生紊乱,蛋白质变性、沉淀坏死,导致癌细胞破灭。一般是将铂电极正极置于癌灶中心部位,周围扎上1～5根铂电极作负极,加上6～10V的电压,控制电流为30～100mA,治疗时间2～6小时,电量为每厘米直径癌灶100～150库仑。此疗法已在推广用于肝癌、皮肤癌等的治疗。对体表肿瘤的治疗尤为简便、有效。控制药物释放技术是指在一定时间内控制药物的释放速度、释放地点,以获得最佳药效,同时缓慢释放有利于降低药物毒性。电化学控制药物释放是一种新的释放药物的方法,这种方法是把药物分子或离子结合到聚合物载体上,使聚合物载体固定在电极表面,构成化学修饰电极,再通过控制电极的氧化还原过程使药物分子或离子释放到溶液中。药物在载体聚合物上的负载方式分为共价键合型和离子键合型负载两类。共价键合负载是通过化学合成将药物分子以共价键方式键合到聚合物骨架上,然后利用涂层法将聚合物固定在固体电极表面形成聚合物膜修饰电极,在氧化或还原过程中药物分子与聚合物之间的共价键断裂,使得药物分子从膜中释放出来。离子键合负载是利用电活性导电聚合物如聚吡咯、聚苯胺等在氧化或还原过程中伴随有作为平衡离子的对离子的嵌入将药物离子负载到聚合物膜中,再通过还原或氧化使药物离子从膜中释放出来。在体研究是生理学研究的重要方法,其目的在于从整体水平上认识细胞、组织、器官的功能机制及其生理活动规律。由于一些神经活性物质(神经递质)具有电化学活性,因此电化学方法首先被用于脑神经系统的在体研究。当采用微电极插入动物脑内进行活体伏安法测定获得成功后,立即引起了人们的极大兴趣[1]。该技术经过不断的改善,被公认为在正常生理状态下跟踪监测动物大脑神经活动最有效的方法。通常可检测的神经递质有多巴胺、去甲肾上腺素、5羟色胺及其代谢产物。微电极伏安法成为连续监测进入细胞间液中原生性神经递质的有力工具。在体研究一般采用快速循环伏安法(每秒上千伏)和快速计时安培法。快速循环伏安法还被用于研究单个神经细胞神经递质释放的研究,发展成为所谓的“细胞电化学”。生物分子的电化学行为的研究是生物电化学的一个基础研究领域,其研究目的在于获取生物分子氧化还原电子转移反应的机理,以及生物分子电催化反应机理,为正确了解生物活性分子的生物功能提供基础数据。所研究的生物分子包括小分子如氨基酸、生物碱、辅酶、糖类等和生物大分子如氧化还原蛋白、RNA、DNA、多糖等。3.电化学生物传感器传感器与通信系统和计算机共同构成现代信息处理系统。传感器相当于人的感官,是计算机与自然界及社会的接口,是为计算机提供信息的工具。传感器通常由敏感(识别)元件、转换元件、电子线路及相应结构附件组成。生物传感器是指用固定化的生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为感元件的传感器。电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件,电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号的传感器。图1是电化学生物传感器基本构成示意图。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件,所以电化学生物传感器具有高度选择性,是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。根据作为敏感元件所用生物材料的不同,电化学生物传感器分为酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等。(1)酶电极传感器以葡萄糖氧化酶(GOD)电极为例简述其工作原理。在GOD的催化下,葡萄糖(C6H12O6)被氧氧化生成葡萄糖酸(C6H12O7)和过氧化氢:根据上述反应,显然可通过氧电极(测氧的消耗)、过氧化氢电极(测H2O2的产生)和pH电极(测酸度变化)来间接测定葡萄糖的含量。因此只要将GOD固定在上述电极表面即可构成测葡萄糖的GOD传感器。这便是所谓的第一代酶电极传感器。这种传感器由于是间接测定法,故干扰因素较多。第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子。第二代酶电极传感器可不受测定体系的限制,测量浓度线性范围较宽,干扰少。现在不少研究者又在努力发展第三代酶电极传感器,即酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子的酶电极传感器。目前已有的商品酶电极传感器包括:GOD电极传感器、L乳酸单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器等。在研究中的酶电极传感器则非常多。(2)微生物电极传感器由于离析酶的价格昂贵且稳定性较差,限制了其在电化学生物传感器中的应用,从而使研究者想到直接利用活的微生物来作为分子识别元件的敏感材料。这种将微生物(常用的主要是细菌和酵母菌)作为敏感材料固定在电极表面构成的电化学生物传感器称为微生物电极传感器。其工作原理大致可分为三种类型:其一,利用微生物体内含有的酶(单一酶或复合酶)系来识别分子,这种类型与酶电极类似;其二,利用微生物对有机物的同化作用,通过检测其呼吸活性(摄氧量)的提高,即通过氧电极测量体系中氧的减少间接测定有机物的浓度;其三,通过测定电极敏感的代谢产物间接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物。微生物电极传感器在发酵工业、食品检验、医疗卫生等领域都有应用。例如:在食品发酵过程中测定葡萄糖的佛鲁奥森假单胞菌电极;测定甲烷的鞭毛甲基单胞菌电极;测定抗生素头孢菌素的Citrobacterfreudii菌电极等等。微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有很好的应用前景,然而它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。(3)电化学免疫传感器抗体对相应抗原具有唯一性识别和结合功能。电化学免疫传感器就是利用这种识别和结合功能将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置。根据电化学免疫传感器的结构可将其分为直接型和间接型两类。直接型的特点是在抗体与其相应抗原识别结合的同时将其免疫反应的信息直接转变成电信号。这类传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。前者是将抗体或抗原直接固定在电极表面上,传感器与相应的抗体或抗原发生结合的同时产生电势改变;后者是用抗体或抗原制作抗体膜或抗原膜,当其与相应的配基反应时,膜电势发生变化,测定膜电势的电极与膜是分开的。间接型的特点是将抗原和抗体结合的信息转变成另一种中间信息,然后再把这个中间信息转变成电信号。这类传感器在结构上也可进一步分为两种类型:结合型和分离型。前者是将抗体或抗原固定在电极上;而后者抗体或抗原和电极是完全分开的。间接型电化学免疫传感器通常是采用酶或其他电活性化合物进行标记,将被测抗体或抗原的浓度信息加以化学放大,从而达到极高的灵敏度。电化学免疫传感器的例子有:诊断早期妊娠的hCG免疫传感器;诊断原发性肝癌的甲胎蛋白(AFP或αFP)免疫传感器;测定人血清蛋白(HSA)免疫传感器;还有IgG免疫传感器、胰岛素免疫传感器等等。(4)组织电极与细胞器电极传感器直接采用动植物组织薄片作为敏感元件的电化学传感器称组织电极传感器,其原理是利用动植物组织中的酶,优点是酶活性及其稳定性均比离析酶高,材料易于获取,制备简单,使用寿命长等。但在选择性、灵敏度、响应时间等方面还存在不足。动物组织电极主要有:肾组织电极、肝组织电极、肠组织电极、肌肉组织电极、胸腺组织电极等。测定对象主要有:谷氨酰胺、葡萄糖胺6磷酸盐、D氨基酸、H2O2、地高辛、胰岛素、腺苷、AMP等。植物组织电极敏感元件的选材范围很广,包括不同植物的根、茎、叶、花、果等。植物组织电极制备比动物组织电极更简单,成本更低并易于保存。细胞器电极传感器是利用动植物细胞器作为敏感元件的传感器。细胞器是指存在于细胞内的被膜包围起来的微小“器官”,如线粒体、微粒体、溶酶体、过氧化氢体、叶绿体、氢化酶颗粒、磁粒体等等。其原理是利用细胞器内所含的酶(往往是多酶体系)。(5)电化学DNA传感器电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种全新思想的生物传感器。其用途是检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质。电化学DNA传感器是利用单链DNA(ssDNA)或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面,加上识别杂交信息的电活性指示剂(称为杂交指示剂)共同构成的检测特定基因的装置。其工作原理是利用固定在电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的同源序列的特异识别作用(分子杂交)形成双链DNA(dsDNA)(电极表面性质改变),同时借助一能识别ssDNA和dsDNA的杂交指示剂的电流响应信号的改变来达到检测基因的目的。已有检测灵敏度高达10-13g/mL的电化学DNA传感器的报道,Hashimoto等[8]采用一个20聚体的核苷酸探针修饰在金电极上检测了PVM623的PatⅠ片断上的致癌基因vmyc。电化学DNA传感器离实用化还有相当距离,主要是传感器的稳定性、重现性、灵敏度等都还有待于提高。有关DNA修饰电极的研究除对于基因检测有重要意义外,还可将DNA修饰电极用于其它生物传感器的研究,用于DNA与外源分子间的相互作用研究[9],如抗癌药物筛选、抗癌药物作用机理研究;以及用于检测DNA结合分子。无疑,它将成为生物电化学的一个非常有生命力的前沿领域。生物电化学所涉及的面非常广,内容很丰富。以上介绍的只是该交叉学科一些领域的概况。可以相信,随着相关学科的发展,生物电化学将进一步蓬勃发展。
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世界精细化工总体发展现状及趋势
精细化工是当今化学工业中最具活力的新兴领域之一，是新材料的重要组成部分。精细化工产品种类多、附加值高、用途广、产业关联度大，直接服务于国民经济的诸多行业和高新技术产业的各个领域。大力发展精细化工已成为世界各国调整化学工业结构、提升化学工业产业能级和扩大经济效益的战略重点。精细化工率(精细化工产值占化工总产值的比例)的高低已经成为衡量一个国家或地区化学工业发达程度和化工科技水平高低的重要标志。
一、世界精细化工总体发展态势
综观近20多年来世界化工发展历程，各国、尤其是美国、欧洲、日本等化学工业发达国家及其著名的跨国化工公司，都十分重视发展精细化工，把精细化工作为调整化工产业结构、提高产品附加值、增强国际竞争力的有效举措，世界精细化工呈现快速发展态势，产业集中度进一步提高。进入21世纪，世界精细化工发展的显著特征是：产业集群化，工艺清洁化、节能化，产品多样化、专用化、高性能化。
1、精细化学品销售收入快速增长，精细化率不断提高
上世纪九十年代以来，基于世界高度发达的石油化工向深加工发展和高新技术的蓬勃兴起，世界精细化工得到前所未有的快速发展，其增长速度明显高于整个化学工业的发展。近几年，全世界化工产品年总销售额约为1.5万亿美元，其中精细化学品和专用化学品约为3800亿美元，年均增长率在5～6%，高于化学工业2～3个百分点。预计至2010年，全球精细化学品市场仍将以6%的年均速度增长。2008年，世界精细化学品市场规模将达到4500亿美元。目前，世界精细化学品品种已超过10万种。精细化率是衡量一个国家和地区化学工业技术水平的重要标志。美国、西欧和日本等化学工业发达国家，其精细化工也最为发达，代表了当今世界精细化工的发展水平。目前，这做胡些国家的精细化率已达到60～70%。近几年，美国精细化学品年销售额约为1250亿美元，居世界首位，欧洲约为1000亿美元，日本约为600亿美元，名列第三。三者合计约占世界总销售额的75%以上。
2、加强技术创新，调整和优化精细化工产品结构
加强技术创新，调整和优化精细化工产品结构，重点开发高性能化、专用化、绿色化产品，已成为当前世界精细化工发展的重要特征，也是今后世界精细化工发展的重点方向。
以精细化工发达的日本为例，技术创新对精细化学品的发展起到至关重要的作用。过去10年中，日本合成染料和传统精细化学品市场缩减了一半，取而代之的是大量开发功能性、绿色化等高端精细化学品，从而大大提升了精细化工的产业能级和经济效益。例如，重点开发用于半导体和平板显示器等电子领域的功能性精细化学品，使日本在信息记录和显示材料等高端产品领域建立了主导地位。在催化剂方面，随着环保法规日趋严格，为适应无硫汽油等环境友好燃料的需要，日本积极开发新型环保型催化剂。目前超深脱硫催化剂等高性能催化剂在日本催化剂工业中已占有相当高的份额，脱硫能力从低于50μg/g提高至低于10μg/g，由此也促进了催化剂工业的整体发展。2004年日本用于深度脱硫等加氢工艺的炼油催化剂产量比上年同期增长了近60%，销售额增长了43%。与此同时，用于石油化学品和汽车尾气净化的催化剂销售额也以两位数的速度增长，已占催化剂市场半壁江山。日本催化剂生产和销售去年分别增长了7%和5%，打破了近六年来的记录。
3、联合兼并重组，增强核心竞争力
许多知名的公司通过兼并、收购或重组，调整经营结构，退出没有竞争力的行业，发挥自己的专长和优势，加大对有竞争力行业的投入,重点发展具有优势的精细化学品，以巩固和扩大市场份额，提高经济效益和国际竞争力。例如，2005年7月，世界著名橡胶助剂生产商——美国康普顿公司(Crompton)花20亿美元收购了大湖化学公司后成立名为“科聚亚”公司(Chemturags)，成为继鲁如键姆哈斯和安格公司后的美国第三大精细化工公司和全球最大的塑料添加剂生产商。新公司的产品包括了塑料添加剂、石化添加剂、阻燃剂、有机金属、聚氨酯、泳池及温泉维护产品及农业化学品，在高价值产品的市场上具有领导地位，其精细化工的年销售额可达到37亿美元。
又如，德固赛和美国塞拉尼斯各出资50%合并羰基合成产品，在欧洲建立丙烯—羰基合渣胡巧成产品生产基地。合并后，羰基合成醇年产量将达到80万吨——占欧洲市场份额的三分之一。与此同时，德固萨公司以6.7亿美元价格将其食品添加剂业务出售给嘉吉公司(Cargill)。从而使嘉吉公司成为食品添加剂行业的领先者，能向全球的食品及饮料公司提供各种专用添加剂。再如，总部位于荷兰海尔伦的皇家帝斯曼公司(DSM)，2003年2月以19.5亿欧元的代价，收购了罗氏全球的维生素、胡萝卜素和精细化工业务，成为世界维生素之王。2004年全球销售额80亿欧元(约为100亿美元)。
二、我国精细化工发展现状与趋势
近十多年来，我国十分重视精细化工的发展，把精细化工、特别是新领域精细化工作为化学工业发展的战略重点之一和新材料的重要组成部分，列入多项国家计划中，从政策和资金上予以重点支持。目前，精细化工业已成为我国化学工业中一个重要的独立分支和新的经济效益增长点。
我国近期出台的《“十一五”化学工业科技发展纲要》又将精细化工列为“十一五”期间优先发展的六大领域之一，并将功能涂料及水性涂料，染料新品种及其产业化技术，重要化工中间体绿色合成技术及新品种，电子化学品，高性能水处理化学品，造纸化学品，油田化学品，功能型食品添加剂，高性能环保型阻燃剂，表面活性剂，高性能橡塑助剂等列为“十一五”精细化工技术开发和产业化的重点。可以预见，随着我国石油化工的蓬勃发展和化学工业由粗放型向精细化方向发展，以及高新技术的广泛应用，我国精细化工自主创新能力和产业技术能级将得到显著提高，成为世界精细化学品生产和消费大国。
1、精细化工取得长足进步，部分产品居世界领先地位我国精细化工的快速发展，不仅基本满足了国民经济发展的需要，而且部分精细化工产品，还具有一定的国际竞争能力，成为世界上重要的精细化工原料及中间体的加工地与出口地，精细化工产品已被广泛应用到国民经济的各个领域和人民日常生活中。统计表明，目前我国精细化工门类已达25个，品种达3万多种，已建成精细化工技术开发中心10个，精细化学品生产能力近1350万吨/年，年总产量近970万吨，年产值超过1000亿元。2004年，我国精细化工率已上升到45%。
近年来，我国的染料产量已跃居世界首位，2004年，染料产量达到了59.83万吨，约占世界染料产量的60%。目前已能生产的品种超过1200个，其中常年生产的品种约700个。我国不仅是世界第一染料生产大国，而且是世界第一染料出口大国，染料出口量居世界第一，约占世界染料贸易量的25%，已成为世界染料生产、贸易的中心，在世界染料市场占有显著地位，2004年出口量达到22.66万吨。涂料产量2004年达到298万吨，比2000年净增104万吨，成为世界第二大涂料生产国。农药产量居世界第二位。柠檬酸的年出口量已接近40万吨，约占全球总消费量的三分之一；维生素C的出口量已突破5万吨，占全球总消费量的50%以上。
2、建设精细化工园区，推进产业集聚
近几年，许多省市都把建设精细化工园区，作为调整地方化工产业布局、提升产业、发展新材料产业、推进集聚的重要举措。据报道，目前全国已建和在建的精细化工园区至少有15个。
例如，浙江上虞精细化工园区规划总面积20平方公里，自1999年1月正式启动以来，共引进来自10个国家、地区和10个省市的项目80多个，资金逾25亿元。到2004年9月已经有140余家精细化工企业入驻，其中年销售收入在500万以上的规模企业有53家，并形成了以染料(颜料)、生物医药及中间体和专用化学品为主要门类的精细化工产业。2003年上虞精细化工产业实现销售收入119.5亿元、利税22.6亿元，出口创汇1.75亿元。基地提出了6年后培育20家高新技术企业，实现技工贸收入300亿元的目标。该园区已被科技部认定为国家火炬计划上虞精细化工特色产业基地。
又如，中国精细化工(常州)开发园区，已形成精细化工为特色，通达上下游多个领域的化工生产和仓储基地。到2003年9月，已累计投资近200亿元，有72家化工企业落户，其中有世界500强中的美国亚什兰化学公司、日本普利司通轮胎公司和韩国现代公司等知名企业。
3、跨国公司加速来华投资，有力推动精细化工发展
跨入21世纪以来，随着经济全球化趋势快速发展，以及我国民经济持续稳步快速发展对精细化学品和特种化学品强大市场需求，吸引了诸多世界著名跨国公司纷纷来我国投资精细化工行业，投资领域涉及精细化工原料和中间体、催化剂、油品添加剂、塑料和橡胶助剂、纺织/皮革化学品、电子化学品、涂料和胶粘剂、发泡剂和制冷剂替代品、食品和饲料添加剂以及医药等，从而有力地推动我国精细化工产业的发展。
例如，世界著名的精细化学品生产商、德国第3大化学品公司德固赛公司看好中国专用化学品市场，1998年以来，德固萨公司已在我国南京、广州、上海、青岛、天津和北京等11个地区建有18家生产厂，2004年实现营业额达到3亿欧元。为了扩大中国市场，并成为中国特种化工领域的领跑者，德古萨去年在上海成立了研发中心，为中国乃至亚洲市场研发专用产品。
又如，世界10大涂料公司已全部进入我国，迄今为止独资和合资建筑涂料厂约16家，生产规模都在2～5万吨/年。
近两年来立邦公司投资41亿日元使廊坊公司和苏州公司的生产能力各扩建为16万吨，上海扩建为14万吨，广州为7万吨，全部项目2005年竣工投产，届时立邦将占中国19%的市场份额。以生产不含铅、汞等有毒有害成分涂料著称的ICI公司声称要在中国市场的争夺中超越立邦成为第一。ICI和立邦的产品销售额现占中国市场的30%。
用于生命科学的电化学技术
由于生命现象与电化学过程密切相关,因此电化学方法在生命科学中得到广泛应用,其内容非常丰富,主要有电脉冲基因直接导入、电场加速作物生长、癌症的电化学疗法、电化学控制药物释放、在体研究的电化学方法、生物分子的电化学行为等。本节简单地介绍一下这些用于生命科学的电化学技术。
电脉冲基因直接导入是基于带负电的质粒DNA或基因片断在高压脉冲电场的作用下被加速“射”向受体细胞,同时在电场作用下细胞膜的渗透率增加(介电击穿效应),使基因能顺利导入受体细胞。由于细胞膜的电击穿的可逆性,除去电场,细胞膜及其所有的功能都能恢复。此法已在分子生物学中得到应用。细胞转化效率高,可达每微克DNA1010个转化体,是用化学方法制备的感受态细胞的转化率的10～20倍。
电场加速作物生长是很新的研究课题。Matsuzaki等报道过玉米和大豆苗在含0 5mmol/LK2SO4培养液中培养,同时加上20Hz,3V或4V(峰 峰)的电脉冲,6天后与对照组相比,秧苗根须发达,生长明显加速。据称其原因可能是电场激励了生长代谢的离子泵作用。
癌症的电化学疗法是瑞典放射医学家Nordenstrom开创的治疗癌症的新方法。其原理是:在直流电场作用下,引起癌灶内一系列生化变化,使其组织代谢发生紊乱,蛋白质变性、沉淀坏死,导致癌细胞破灭。一般是将铂电极正极置于癌灶中心部位,周围扎上1～5根铂电极作负极,加上6～10V的电压,控制电流为30～100mA,治疗时间2～6小时,电量为每厘米直径癌灶100～150库仑。此疗法已在推广用于肝癌、皮肤癌等的治疗。对体表肿瘤的治疗尤为简便、有效。
控制药物释放技术是指在一定时间内控制药物的释放速度、释放地点,以获得最佳药效,同时缓慢释放有利于降低药物毒性。电化学控制药物释放是一种新的释放药物的方法,这种方法是把药物分子或离子结合到聚合物载体上,使聚合物载体固定在电极表面,构成化学修饰电极,再通过控制电极的氧化还原过程使药物分子或离子释放到溶液中。药物在载体聚合物上的负载方式分为共价键合型和离子键合型负载两类。共价键合负载是通过化学合成将药物分子以共价键方式键合到聚合物骨架上,然后利用涂层法将聚合物固定在固体电极表面形成聚合物膜修饰电极,在氧化或还原过程中药物分子与聚合物之间的共价键断裂,使得药物分子从膜中释放出来。离子键合负载是利用电活性导电聚合物如聚吡咯、聚苯胺等在氧化或还原过程中伴随有作为平衡离子的对离子的嵌入将药物离子负载到聚合物膜中,再通过还原或氧化使药物离子从膜中释放出来。
在体研究是生理学研究的重要方法,其目的在于从整体水平上认识细胞、组织、器官的功能机制及其生理活动规律。由于一些神经活性物质(神经递质)具有电化学活性,因此电化学方法首先被用于脑神经系统的在体研究。当采用微电极插入动物脑内进行活体伏安法测定获得成功后,立即引起了人们的极大兴趣[1]。该技术经过不断的改善,被公认为在正常生理状态下跟踪监测动物大脑神经活动最有效的方法。通常可检测的神经递质有多巴胺、去甲肾上腺素、5 羟色胺及其代谢产物。微电极伏安法成为连续监测进入细胞间液中原生性神经递质的有力工具。在体研究一般采用快速循环伏安法(每秒上千伏)和快速计时安培法。快速循环伏安法还被用于研究单个神经细胞神经递质释放的研究,发展成为所谓的“细胞电化学”。
生物分子的电化学行为的研究是生物电化学的一个基础研究领域,其研究目的在于获取生物分子氧化还原电子转移反应的机理,以及生物分子电催化反应机理,为正确了解生物活性分子的生物功能提供基础数据。所研究的生物分子包括小分子如氨基酸、生物碱、辅酶、糖类等和生物大分子如氧化还原蛋白、RNA、DNA、多糖等。
3. 电化学生物传感器
传感器与通信系统和计算机共同构成现代信息处理系统。传感器相当于人的感官,是计算机与自然界及社会的接口,是为计算机提供信息的工具。
传感器通常由敏感(识别)元件、转换元件、电子线路及相应结构附件组成。生物传感器是指用固定化的生物体成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身(细胞、细胞器、组织等)作为感元件的传感器。电化学生物传感器则是指由生物材料作为敏感元件,电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件,以电势或电流为特征检测信号的传感器。图1是电化学生物传感器基本构成示意图。由于使用生物材料作为传感器的敏感元件,所以电化学生物传感器具有高度选择性,是快速、直接获取复杂体系组成信息的理想分析工具。一些研究成果已在生物技术、食品工业、临床检测、医药工业、生物医学、环境分析等领域获得实际应用。
根据作为敏感元件所用生物材料的不同,电化学生物传感器分为酶电极传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感器、组织电极与细胞器电极传感器、电化学DNA传感器等。
(1) 酶电极传感器
以葡萄糖氧化酶(GOD)电极为例简述其工作原理。在GOD的催化下,葡萄糖(C6H12O6)被氧氧化生成葡萄糖酸(C6H12O7)和过氧化氢:
根据上述反应,显然可通过氧电极(测氧的消耗)、过氧化氢电极(测H2O2的产生)和pH电极(测酸度变化)来间接测定葡萄糖的含量。因此只要将GOD固定在上述电极表面即可构成测葡萄糖的GOD传感器。这便是所谓的第一代酶电极传感器。这种传感器由于是间接测定法,故干扰因素较多。第二代酶电极传感器是采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子。第二代酶电极传感器可不受测定体系的限制,测量浓度线性范围较宽,干扰少。现在不少研究者又在努力发展第三代酶电极传感器,即酶的氧化还原活性中心直接和电极表面交换电子的酶电极传感器。 目前已有的商品酶电极传感器包括:GOD电极传感器、L 乳酸单氧化酶电极传感器、尿酸酶电极传感器等。在研究中的酶电极传感器则非常多。
(2) 微生物电极传感器
由于离析酶的价格昂贵且稳定性较差,限制了其在电化学生物传感器中的应用,从而使研究者想到直接利用活的微生物来作为分子识别元件的敏感材料。这种将微生物(常用的主要是细菌和酵母菌)作为敏感材料固定在电极表面构成的电化学生物传感器称为微生物电极传感器。其工作原理大致可分为三种类型:其一,利用微生物体内含有的酶(单一酶或复合酶)系来识别分子,这种类型与酶电极类似;其二,利用微生物对有机物的同化作用,通过检测其呼吸活性(摄氧量)的提高,即通过氧电极测量体系中氧的减少间接测定有机物的浓度;其三,通过测定电极敏感的代谢产物间接测定一些能被厌氧微生物所同化的有机物。
微生物电极传感器在发酵工业、食品检验、医疗卫生等领域都有应用。例如:在食品发酵过程中测定葡萄糖的佛鲁奥森假单胞菌电极;测定甲烷的鞭毛甲基单胞菌电极;测定抗生素头孢菌素的Citrobacterfreudii菌电极等等。微生物电极传感器由于价廉、使用寿命长而具有很好的应用前景,然而它的选择性和长期稳定性等还有待进一步提高。
(3) 电化学免疫传感器
抗体对相应抗原具有唯一性识别和结合功能。电化学免疫传感器就是利用这种识别和结合功能将抗体或抗原和电极组合而成的检测装置。
根据电化学免疫传感器的结构可将其分为直接型和间接型两类。直接型的特点是在抗体与其相应抗原识别结合的同时将其免疫反应的信息直接转变成电信号。这类传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。前者是将抗体或抗原直接固定在电极表面上,传感器与相应的抗体或抗原发生结合的同时产生电势改变;后者是用抗体或抗原制作抗体膜或抗原膜,当其与相应的配基反应时,膜电势发生变化,测定膜电势的电极与膜是分开的。间接型的特点是将抗原和抗体结合的信息转变成另一种中间信息,然后再把这个中间信息转变成电信号。这类传感器在结构上也可进一步分为两种类型:结合型和分离型。前者是将抗体或抗原固定在电极上;而后者抗体或抗原和电极是完全分开的。间接型电化学免疫传感器通常是采用酶或其他电活性化合物进行标记,将被测抗体或抗原的浓度信息加以化学放大,从而达到极高的灵敏度。
电化学免疫传感器的例子有:诊断早期妊娠的hCG免疫传感器;诊断原发性肝癌的甲胎蛋白(AFP或αFP)免疫传感器;测定人血清蛋白(HSA)免疫传感器;还有IgG免疫传感器、胰岛素免疫传感器等等。
(4) 组织电极与细胞器电极传感器
直接采用动植物组织薄片作为敏感元件的电化学传感器称组织电极传感器,其原理是利用动植物组织中的酶,优点是酶活性及其稳定性均比离析酶高,材料易于获取,制备简单,使用寿命长等。但在选择性、灵敏度、响应时间等方面还存在不足。
动物组织电极主要有:肾组织电极、肝组织电极、肠组织电极、肌肉组织电极、胸腺组织电极等。测定对象主要有:谷氨酰胺、葡萄糖胺 6 磷酸盐、D 氨基酸、H2O2、地高辛、胰岛素、腺苷、AMP等。 植物组织电极敏感元件的选材范围很广,包括不同植物的根、茎、叶、花、果等。植物组织电极制备比动物组织电极更简单,成本更低并易于保存。
细胞器电极传感器是利用动植物细胞器作为敏感元件的传感器。细胞器是指存在于细胞内的被膜包围起来的微小“器官”,如线粒体、微粒体、溶酶体、过氧化氢体、叶绿体、氢化酶颗粒、磁粒体等等。其原理是利用细胞器内所含的酶(往往是多酶体系)。
(5) 电化学DNA传感器
电化学DNA传感器是近几年迅速发展起来的一种全新思想的生物传感器。其用途是检测基因及一些能与DNA发生特殊相互作用的物质。电化学DNA传感器是利用单链DNA(ssDNA)或基因探针作为敏感元件固定在固体电极表面,加上识别杂交信息的电活性指示剂(称为杂交指示剂)共同构成的检测特定基因的装置。其工作原理是利用固定在电极表面的某一特定序列的ssDNA与溶液中的同源序列的特异识别作用(分子杂交)形成双链DNA(dsDNA)(电极表面性质改变),同时借助一能识别ssDNA和dsDNA的杂交指示剂的电流响应信号的改变来达到检测基因的目的。
已有检测灵敏度高达10-13g/mL的电化学DNA传感器的报道,Hashimoto等[8]采用一个20聚体的核苷酸探针修饰在金电极上检测了PVM623的PatⅠ片断上的致癌基因v myc。电化学DNA传感器离实用化还有相当距离,主要是传感器的稳定性、重现性、灵敏度等都还有待于提高。有关DNA修饰电极的研究除对于基因检测有重要意义外,还可将DNA修饰电极用于其它生物传感器的研究,用于DNA与外源分子间的相互作用研究[9],如抗癌药物筛选、抗癌药物作用机理研究;以及用于检测DNA结合分子。无疑,它将成为生物电化学的一个非常有生命力的前沿领域。
生物电化学所涉及的面非常广,内容很丰富。以上介绍的只是该交叉学科一些领域的概况。可以相信,随着相关学科的发展,生物电化学将进一步蓬勃发展。
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