感受态细胞储存？感受态细胞常温放置

奔跑的细胞 2023年04月11日 18:06 246 0

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目录一览：

1、感受态细胞为何放置于负八十冰箱保存？
2、感受态细胞为何放置于负八十冰箱保存
3、感受态细胞为什么要放倒-80度保存

感受态细胞为何放置于负八十冰箱保存？

感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，吸收周围环境中的DNA分子，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

主要原理

通过处理使细胞的通透性变大

性质

活细胞

制作方法

CaCl2法

1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞

细胞壁通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。

联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。

2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。

感受态细胞为何放置于负八十冰箱保存

感受态细胞可不可以用液氮保存

如果没有-80冰箱,感受态细胞可不可以保存在液氮里?

有朋友说“ 大部分都不存放在液氮中，主要是其达不到要求的低温环境。多方在-80度冰箱中保存。”

我的回答：

液氮温度低于-196℃，我放在里面都怕冻坏了感受态细胞，怎么能达不到-80呢？

我的主要问题在于：会不会把感受态细胞冻坏，另外，能存放多长时间，总RNA的提取（Trizol法提取）

在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。

1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提

取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；

2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟；

3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP

管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；

4.取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙

醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；

5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g

（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；

6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；

7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

PCR

实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：

TaKaRa Taq TM或TaKaRa E X Taq TM的配方

分子生物学实验室常用实验方法